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Méthodologie immunohistochimique pour l'utilisation des anticorps
Novocastra
sur des tissus musculaires congelés.
TM
Réactifs nécessaires mais non fournis
1.
Solvants standard utilisés en immunohistochimie.
2.
Tampon Tris (TBS) 50 mM, pH 7,6.
3.
Diluant anticorps – sérum normal dilué de façon optimale dans du TBS.
4.
Sérums normaux provenant de diverses espèces chez lesquelles l'anticorps secondaire est cultivé.
5.
Anticorps secondaire conjugué à la peroxydase - utiliser selon les recommandations du fabricant.
6.
Tétrachlorhydrate de 3,3'-diaminobenzidine (DAB) - utiliser selon les recommandations du fabricant.
7.
Milieu de montage - utiliser selon les recommandations du fabricant.
Équipements nécessaires mais non fournis
1.
Incubateur réglé à 25 °C.
2.
Équipements généraux de laboratoire d'immunohistochimie.
3.
Ventilateur électrique pour sécher les lames à l'air.
Solutions de restauration des antigènes (voir Recommandations d'utilisation)
Non applicables sur des coupes congelées.
Méthodologie
Avant d'utiliser cette méthodologie, les utilisateurs doivent avoir été formés aux techniques immunohistochimiques.
Les utilisateurs doivent déterminer les dilutions optimales des anticorps. Sauf mention contraire, toutes les étapes sont réalisées à 25 °C.
1.
Découper et monter des coupes de 4 à 10 µm sur des lames revêtues d'un adhésif adapté au tissu et laisser sécher à l'air pendant
une heure.
2.
Incuber les coupes avec l'anticorps primaire dilué de façon optimale (voir Recommandations d'utilisation).
3.
Laver dans du tampon TBS pendant 2 fois pendant 5 minutes sous agitation légère.
4.
Incuber les coupes dans l'anticorps secondaire conjugué à la peroxydase approprié.
5.
Laver dans du tampon TBS pendant 2 fois pendant 5 minutes sous agitation légère.
6.
Incuber les lames dans le DAB.
7.
Rincer les lames à l'eau propre.
8.
Déshydrater, assécher et monter les coupes.
Amendements apportés à la version précédente
Non applicable.
Date de publication
5 février 2004 (CEprotocol/Frozen Muscle).
G-SARC-CE
Page 10
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