Leica BIOSYSTEMS NCL-g-SARC Mode D'emploi page 21

Immunhistochemisches Vorgehen beim Einsatz von Novocastra
Antikörpern für gefrorenes Muskelgewebe.
Zusätzlich benötigte, aber nicht mitgelieferte Reagenzien
1. In der Immunhistochemie übliche Standardlösungsmittel.
2. 50 mmol/l Tris-gepufferte physiologische Kochsalzlösung (Tris-Buffered Saline, TBS) pH-Wert 7,6.
3. Antikörper-Verdünnungsmittel – optimal in TBS verdünntes Normalserum.
4. Normalseren der Spezies, in denen der sekundäre Antikörper gezüchtet wird.
5. Sekundärer, peroxidase-konjugierter Antikörper – gemäß den Empfehlungen des Herstellers zu verwenden.
6. 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) - gemäß den Empfehlungen des Herstellers anzusetzen und zu verwenden.
7. Eindeckmedium - gemäß den Empfehlungen des Herstellers zu verwenden.
Zusätzlich benötigte, aber nicht mitgelieferte Ausrüstung
1. Inkubator, auf 25 C eingestellt.
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2. Übliche immunhistochemische Laborausstattung.
3 Elektroventilator zum Lufttrocknen von Objektträgern.
Antigen-Retrieval-Lösungen (siehe Gebrauchsempfehlungen)
Nicht für gefrorene Schnitte zutreffend.
Vorgehensweise
Vor Anwendung dieser Methodik müssen die Benutzer in immunhistochemischen Techniken unterrichtet werden.
Die Benutzer müssen die optimale Verdünnung für die Antikörper bestimmen. Sofern nicht anderweitig vorgegeben, werden alle Schritte bei
Raumtemperatur (25 C) durchgeführt.
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1. Schnitte von 4–10 μm schneiden und auf Objektträgern aufbringen, die mit einem geeigneten Gewebehaftmaterial beschichtet sind,
und mindestens eine Stunde lang an der Luft trocknen lassen.
2. Die Schnitte mit optimal verdünntem primären Antikörper inkubieren (siehe Gebrauchsempfehlungen)
3. Die Schnitte in TBS-Puffer 2 x 5 Minuten lang mit sanfter Kippbewegung spülen.
4. Die Schnitte mit einem entsprechenden peroxidase-konjugierten, sekundären Antikörper inkubieren.
5. Die Schnitte in TBS-Puffer 2 x 5 Minuten lang mit sanfter Kippbewegung spülen.
6. Die Objektträger in DAB inkubieren.
7. Die Objektträger mit sauberem Wasser abspülen.
8. Die Schnitte dehydrieren, säubern und aufbringen.
Änderungen zur vorhergehenden Ausgabe
Keine.
Ausgabedatum
5. Februar 2004 (CEprotocol/Frozen Muscle).
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TM
G-SARC-CE
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