Leica BIOSYSTEMS NCL-g-SARC Mode D'emploi page 39

Μεθοδολογία ανοσοϊστοχημείας για χρήση αντισωμάτων Novocastra
σε κατεψυγμένο μυϊκό ιστό.
Αντιδραστήρια που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται
1. Πρότυποι διαλύτες που χρησιμοποιούνται στην ανοσοϊστοχημεία.
2. 50 mM αλατούχου ρυθμιστικού διαλύματος Tris (TBS) pH7,6.
3. Αραιωτικό αντισώματος - φυσιολογικός ορός βέλτιστα αραιωμένος σε TBS.
4. Φυσιολογικοί οροί από το είδος στο οποίο αναπτύσσεται το δευτεροταγές αντίσωμα.
5. Δευτεροταγές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση - χρησιμοποιείτε όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή.
6. Τετραϋδροχλωρική 3,3' διαμινοβενζιδίνη (DAB) - παρασκευάζετε και χρησιμοποιείτε σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή.
7. Μέσο στερέωσης – χρησιμοποιείτε σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή.
Εξοπλισμός που απαιτείται αλλά δεν παρέχεται
1. Θάλαμος επώασης ρυθμισμένος στους 25 °C.
2. Γενικός εργαστηριακός εξοπλισμός ανοσοϊστοχημείας.
3. Ηλεκτρικός ανεμιστήρας για στέγνωμα των αντικειμενοφόρων πλακών με αέρα.
Διαλύματα ανάκτησης αντιγόνου (δείτε την ενότητα "Συστάσεις για τη χρήση")
Δεν ισχύει για κατεψυγμένες τομές.
Μεθοδολογία
Πριν από την εφαρμογή της μεθοδολογίας αυτής, οι χρήστες πρέπει εκπαιδευτούν σε ανοσοϊστοχημικές τεχνικές.
Οι χρήστες θα πρέπει να προσδιορίσουν τις βέλτιστες αραιώσεις για αντισώματα. Εκτός εάν υποδεικνύεται διαφορετικά, όλα τα βήματα
εκτελούνται στους 25 °C.
1. Κόψτε και στερεώστε τομές 4–10 μm σε αντικειμενοφόρους πλάκες επικαλυμμένες με κατάλληλο συγκολλητικό ιστών και στεγνώστε
με αέρα επί μία ώρα τουλάχιστον.
2. Επωάστε τις τομές με βέλτιστα αραιωμένο πρωτοταγές αντίσωμα (δείτε την ενότητα "Συστάσεις για τη χρήση").
3. Πλύνετε σε ρυθμιστικό διάλυμα TBS επί 2 x 5 λεπτά με απαλή ανακίνηση.
4. Επωάστε τις τομές σε κατάλληλο δευτεροταγές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση.
5. Πλύνετε σε ρυθμιστικό διάλυμα TBS επί 2 x 5 λεπτά με απαλή ανακίνηση.
6. Επωάστε τις αντικειμενοφόρους πλάκες σε DAB.
7. Εκπλύντε τις αντικειμενοφόρους πλάκες σε καθαρό νερό.
8. Αφυδατώστε, καθαρίστε και στερεώστε τις τομές.
Τροποποιήσεις στην προηγούμενη έκδοση
Δεν έχει εφαρμογή.
Ημερομηνία έκδοσης
5 Φεβρουαρίου 2004 (CEprotocol/Frozen Muscle).
TM
G-SARC-CE
Page 38