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Le concept de PCR numérique existe depuis 1992, lorsque Sykes et al. (1) l'ont décrite comme une « PCR à dilution
limitative ». Cette méthode générale utilise l'analyse des points limites et les statistiques de Poisson pour quantifier le
nombre absolu de molécules d'acide nucléique présentes dans un échantillon. Ces travaux ont été suivis par les travaux
révolutionnaires de Vogelstein et Kinzler en 1999, qui ont mis au point une méthode dans laquelle l'échantillon est dilué et
réparti dans des réactions individuelles appelées compartiments, et des produits uniques avec des signaux de fluorescence
sont détectés et analysés après l'amplification. Ils ont ensuite inventé le terme « PCR numérique », que nous connaissons
tous aujourd'hui.
Dilution de l'échantillon et préparation
du mélange de réaction PCR
Bleu – Cible
Rouge – Fond (ADNg, ADNc ;
amorces/sondes ; Master Mix)
Figure 4. Quantification absolue en 4 étapes.
Si l'échantillon est préparé de la même manière pour la qPCR, la séparation de l'échantillon, qui consiste à diviser
l'échantillon en milliers de réactions individuelles avant l'amplification, est propre à la PCR numérique. Grâce à la
répartition aléatoire des molécules en compartiments, contrairement à l'analyse en bloc effectuée dans le cadre de la
qPCR, la PCR numérique minimise les effets des cibles concurrentes et renforce la précision et la sensibilité afin d'améliorer
la détection des cibles rares dans l'échantillon des chercheurs ou des patients.
La PCR numérique permet aux chercheurs de :
Quantifier les cibles à faible abondance ou les cibles dans des contextes complexes
•
Détecter et discriminer les variantes alléliques (SNP)
•
Enregistrer les petites modifications des niveaux cibles qui seraient autrement indétectables par qPCR
•
Contrairement à la qPCR en temps réel, la dPCR ne dépend pas de chaque cycle d'amplification pour déterminer la
quantité relative de la molécule cible, qui peut être sujette à des différences d'efficacité d'amplification. La dPCR s'appuie
plutôt sur les statistiques des distributions de Poisson et Binomiale pour déterminer la quantité absolue de la cible à la suite
d'une amplification au point limite, ce qui réduit l'impact des différences d'efficacité sur le résultat.
Comme les molécules cibles sont réparties aléatoirement dans tous les compartiments disponibles et que toutes les
séparations contiennent le même volume d'échantillon, la distribution des gènes cibles encapsulés dans les séparations du
puits suit une distribution de Poisson du paramètre λ. De plus, la distribution des compartiments positifs dans le puits suit
une distribution binomiale de probabilité
à partir des équations suivantes :
�
−
λ =
In
20
Séparation des réactions
PCR en milliers de
réactions individuelles
������������������������ �������� �������������������������������� ���� ������������ ���� ������������ ���� ���� ��������
������������������������ �������� ���������������������������� ���� ���� ������������ ���� ������������ ���� ���� ��������
Amplification PCR en point limite
des compartiments
Vert – Réactions positives
Bleu – Réactions négatives
. Cela permet d'estimer la concentration de la cible dans l'échantillon,
������������������������ �������� �������������������������������� ���� ������������ ���� ���������������� ���� ���� ���� ����
−
Relevé et quantification
absolue
Manuel d'utilisation du système QIAcuityDx | 07/2024
�
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