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Évaluation des signaux et énumération
Pour évaluer la qualité des signaux et énumérer les signaux HER2 et CEP17, suivre le
processus ci-dessous :
1. Évaluer la
qualité des
lames
- Intensité du signal
de la sonde
- Fond
2. Reconnaissance
des signaux cibles
- Vue d'ensemble des
tissus
- Profondeur de foyer
3. Pertinence
des noyaux
- Sélection des
noyaux
4. Énumération
des signaux
- Vue d'ensemble
des tumeurs
- Comptage
Leica Biosystems Mode d'emploi du Leica HER2 FISH System - 30 Test TA9217 EU-FR-CE-Rev_F 17/07/2015
1. Évaluer la qualité des lames
Évaluer la qualité des lames selon les critères suivants :
• Intensité du signal de la sonde : les signaux doivent être clairs et faciles
à évaluer. Les signaux doivent avoir soit des formes ovales, brillantes et
compactes, soit des formes ovales,filiformes et diffuses.
• Fond : le fond doit être relativement exempt de particules fluorescentes
et apparaître sombre ou noir.
Consulter le guide de dépannage (Tableau 6) si l'une des caractéristiques
ci-dessus est insatisfaisante et recommencer le test si nécessaire.
2. Reconnaissance des signaux cibles
S'assurer que les filtres corrects sont utilisés pour l'analyse :
• Vue d'ensemble des tissus : les signaux d'hybridation ne doivent être
énumérés que pour les cellules tumorales invasives. Les cellules tumorales
se distinguent généralement des cellules normales par leur taille : en général,
elles sont plus grandes que les cellules normales, les lymphocytes et les
cellules épithéliales. Identifier et sélectionner les zones cibles avec la coloration
H & E et marquer ces zones sur le couvre-lame après l'exécution du test FISH.
• Profondeur de foyer : ajuster la profondeur du foyer afin de déterminer
la profondeur du plan focal et se familiariser avec la forme et la taille des
signaux cibles et du bruit (débris).
3. Pertinence des noyaux
Observer la zone hybridée avec un objectif 20X :
• Sélection des noyaux : repérer la zone cible d'intérêt (cellules tumorales
identifées par la coloration H & E). Éviter les zones dont les bordures
nucléaires sont indistinctes ou dont les cellules sont nécrotiques.
• De plus, il convient d'ignorer les signaux de faible intensité et non
spécifiques, ayant un bruit de fond ou une contre-coloration insuffisante
pour la détermination de la bordure nucléaire. Seuls, les noyaux dont les
signaux sont discrets doivent être énumérés.
4. Énumération des signaux
• Vue d'ensemble des tumeurs : balayer plusieurs zones de cellules
tumorales en utilisant un objectif 40X, afin de distinguer une éventuelle
hétérogénéité. Éviter les zones de la cible dont les signaux sont faibles et
sélectionner une zone dont la distribution nucléaire est satisfaisante.
• Comptage : commencer l'analyse par le quadrant supérieur gauche de la
zone sélectionnée et, en balayant de gauche à droite, compter le nombre
de signaux présents dans les limites nucléaires en utilisant un objectif 100X,
conformément aux indications fournies ci-dessous et dans la Figure 1.
• Repérer tous les signaux présents dans le noyau en faisant une mise au
point (axe Z).
• Compter comme un signal deux signaux qui sont de même taille et séparés
par une distance égale ou inférieure au diamètre du signal.
• Les noyaux n'ayant aucun signal ou ayant des signaux d'une seule couleur
ne doivent pas être notés. Noter seulement les noyaux ayant un ou
plusieurs signaux FISH de chaque couleur.
• Compter le nombre de signaux HER2 et le nombre de signaux CEP17 pour
chaque noyau. Alterner les jeux de filtres orange (HER2), vert (CEP17),
vert/orange et DAPI/vert/orange pour voir deux couleurs, si nécessaire.
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