Leica BIOSYSTEMS Novocastra Mode D'emploi page 61

Nedodržanie predpísaných inkubačných dôb alebo teplôt môže viesť k nesprávnym výsledkom. Všetky takéto zmeny si vyžadujú
validáciu používateľom.
Kontrola kvality
Rozdiely v spracovaní tkaniva a technických postupoch v laboratóriu používateľa môžu viesť k významnému kolísaniu výsledkov, čo si
vyžaduje, okrem nasledujúcich postupov, aj pravidelné interné kontroly.
Kontroly by mali byť čerstvé pitevné/bioptické/chirurgické vzorky fixované čo najskôr formalínom a spracované zaliatím do parafínu
rovnakým spôsobom ako vzorky pacienta.
Pozitívna kontrola tkanivom
Identifikuje správne pripravené tkanivá a správne techniky zafarbenia.
Každá súprava testových podmienok v každom cykle zafarbenia musí obsahovať jednu pozitívnu kontrolu tkanivom.
Tkanivo so slabým pozitívnym farbením je pre optimálnu kontrolu kvality a na detekciu slabšej degradácie činidla vhodnejšie než tkanivo
so silným pozitívnym farbením.
Odporúčané tkanivo na pozitívnu kontrolu je koža.
Ak pozitívna kontrola tkanivom nebude vykazovať pozitívne zafarbenie, výsledky testovaných vzoriek je nutné považovať za neplatné.
Negatívna kontrola tkanivom
Nutné vyšetriť po pozitívnej kontrole tkanivom s cieľom overiť špecificitu značenia cieľového antigénu primárnou protilátkou.
Odporúčané tkanivo na negatívnu kontrolu je mozoček.
Ako negatívnu kontrolu je možné použiť aj rôzne typy buniek prítomné vo väčšine tkanivových rezov, takýto postup si však vyžaduje
validáciu používateľom.
Prípadné nešpecifické farbenie má obvykle difúzny vzhľad. V rezoch tkanív silne fixovaných formalínom môže byť pozorované
sporadické farbenie spojiva. Na interpretáciu výsledkov farbenia používajte intaktné bunky. Nekrotické alebo degenerované bunky
sa často farbia nešpecificky.
3
produktov reakcie substrátu. Môžu byť spôsobené aj endogénnymi enzýmami, ako napr. pseudoperoxidázou (erytrocyty), endogénnou
peroxidázou (cytochróm C) alebo endogénnym biotínom (napr. pečeň, prsník, mozog, oblička) v závislosti od typu imunologického
farbenia. S cieľom diferencovať endogénnu enzymatickú aktivitu alebo nešpecifickú väzbu enzýmov od špecifickej imunoreaktivity
môžete nafarbiť ďalšie vzorky tkanív pacienta výhradne substrátovým chromogénom alebo enzymatickými komplexmi (avidín-biotín,
streptavidín, značený polymér), resp. substrátovým chromogénom. V prípade špecifického farbenia v negatívnej kontrole tkanivom je
nutné výsledky vzoriek pacienta považovať za neplatné.
Negatívna kontrola činidlom
Na vyhodnotenie nešpecifického zafarbenia použite nešpecifickú negatívnu kontrolu činidlom miesto primárnej protilátky s rezom
jednotlivých vzoriek pacienta, čo umožní lepšiu interpretáciu špecifického farbenia na mieste antigénu.
Tkanivo pacienta
Pacientske vzorky zafarbené prípravkom NCL-L-5D3 preskúmajte ako posledné. Intenzitu pozitívneho farbenia je nutné
vyhodnotiť v kontexte prípadného nešpecifického zafarbenia negatívnej kontroly činidlom na pozadí. Podobne ako pri všetkých
imunohistochemických testov znamená negatívny výsledok, že antigén nebol detegovaný. Nepotvrdzuje jeho absenciu v testovaných
bunkách/tkanivách. V prípade potreby identifikujte falošne negatívne reakcie pomocou panelu protilátok.
Očakávané výsledky
Normálne tkanivá
Klon 5D3 detegoval cytokeratíny 8 a 18 v cytoplazme všetkých jednoduchých žľazových a prechodných epitelov. Zafarbenie nebolo
pozorované v normálnych stratifikovaných skvamóznych epiteloch z rôznych miest okrem vrstvy bazálnych buniek a rôznych
neepitelových tkanív (celkový počet normálnych vyšetrených tkanív = 158).
Abnormálne tkanivá
Klon 5D3 zafarbil 25/33 adenokarcinómov hrubého čreva, 2/3 skvamocelulárnych karcinómov pažeráka, 3/3 adenokarcinómov žalúdka,
2/3 adenokarcinómov pľúc, 2/3 adenokarcinómov pankreasu, 3/3 urotelových karcinómov močového mechúra nízkeho stupňa, 1/2
papilárnych karcinómov štítnej žľazy, 3/3 invazívnych duktálnych karcinómov prsníka, 2/3 skvamocelulárnych karcinómov krčka
maternice, 2/2 adenokarcinómov prostaty a 5/5 adenokarcinómov močového mechúra. Žiadne zafarbenie nebolo pozorované v prípade
0/3 astrocytómov a 0/3 renálnych svetlobunkových karcinómov (celkový počet abnormálnych vyšetrených prípadov = 69).
Prípravok NCL-L-5D3 sa odporúča na detekciu proteínov ľudského cytokeratínu 8 a 18 v normálnych a
neoplastických tkanivách ako doplnok konvenčnej histopatológie použitím neimunologických histochemických
farbení.
Všeobecné limitácie
Imunohistochémia je diagnostický postup pozostávajúci z viacerých krokov, ktorý si vyžaduje špecializované zaškolenie vo výbere
zodpovedajúcich činidiel, výbere tkanív, fixácie a spracovania, príprave IHC sklíčka a interpretácii výsledkov farbenia.
Farbenie tkaniva závisí od manipulácie s tkanivom a od jeho spracovania pred farbením. Nesprávna fixácia,
zmrazovanie,rozmrazovanie, premývanie, sušenie, ohrievanie, rezanie alebo kontaminácia inými tkanivami či tekutinami môžu viesť
k vzniku artefaktov, záchytu protilátok alebo falošne negatívnym výsledkom. Inkonzistentné výsledky môžu byť spôsobené zmenami
metód fixácie a montáže preparátov alebo inherentnými nepravidelnosťami v tkanive.
Nadmerné alebo neúplné kontrastné farbenie môže narušiť správnosť interpretácie výsledkov.
Klinická interpretácia akéhokoľvek farbenia alebo jeho absencie musí byť kombinovaná s morfologickými vyšetreniami za použitia
zodpovedajúcich kontrol. Výsledky je nutné vyhodnotiť v kontexte klinickej anamnézy pacienta a iných diagnostických testov vedených
kvalifikovaným patológom.
Protilátky spoločnosti Leica Biosystems Newcastle Ltd sú určené na použitie na zmrazených rezoch alebo rezoch zaliatych parafínom
so špecifickými požiadavkami na fixáciu, ako uvádza tento dokument. Najmä pri neopláziách môže dôjsť k nečakanej expresii antigénov.
Klinická interpretácia akýchkoľvek farbených tkanivových rezov musí zahŕňať morfologickú analýzu a vyhodnotenie zodpovedajúcich
kontrol.
5D3-L-CE
Page 60
2
Falošne pozitívne výsledky môžu byť pozorované v dôsledku neimunologickej väzby proteínov alebo
4