Leica Kreatech FISH probes Mode D'emploi
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Sommaire des Matières pour Leica Kreatech FISH probes

  • Page 1 Kreatech™ FISH probes - Instructions for use - Mode d’emploi - Instruções de uso...
  • Page 3 Kreatech FISH probes Table of Contents - Instructions for use - Mode d’emploi - Instruções de uso...
  • Page 4 Kreatech FISH probes...
  • Page 5 Kreatech FISH probes FISH Procedure 1 Instructions for use Formalin-fixed paraffin-embedded tissue Using Kreatech FISH probes Fluorescent in situ hybridization (FISH) is used to identify, or label, target genomic sequences so that their location can be studied. DNA sequences from appropriate, chromosome specific probes are first labeled with reporter molecules.
  • Page 6 Kreatech FISH probes As an alternative the following protocols can also be used: Slide pretreatment 1. Mount 4 - 6 μm formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue sections on positively charged slides. 2. Bake mounted FFPE tissue sections for 2 hours at 80 °C or 16 hours at 56 °C.
  • Page 7 Briefly spin down probe vial, vortex probe vial and briefly spin down again before use. Allow probe to reach RT before use. Research Use Only (RUO) Kreatech FISH probes are supplied Ready- -to-use (RtU) unless specified otherwise in the product documenta- tion.
  • Page 8 Kreatech FISH probes Co-denaturation: 1. Apply 10 μl of probe or probe-mix per 22 x 22 mm field. 2. Cover with glass coverslip and seal with Fixogum (LK-071A) or rubber cement. 3. Denature sample and probe on a ThermoBrite (TS-01/02) for 5 min at 80 °C.
  • Page 9 Kreatech FISH probes Recommendations for fluorescence microscopy: For optimal visualization use a well maintained and regularly calibrated microscope equipped with a 100W mercury lamp or other appropriate light source and a 63x or 100x fluorescence objective. Triple band-pass filters (DAPI/FITC/Cy3 or DAPI/FITC/TRITC) are used to view multiple colors, single band-pass filters are used for individual color visualization.

  • Page 10: Frequently Asked Questions

    Kreatech FISH probes 4. Briefly spin down probe vial, vortex probe vial and then spin down probe vial again. 5. Apply probe to denatured slide, cover with glass coverslip, seal with rubber cement and proceed with Hybridization. Frequently asked questions I have weak or no signals •...
  • Page 11 Kreatech FISH probes Minimum probe application: Glass cover slip size Minimum probe application 22 x 22 mm 10 μl 22 x 32 mm 15 μl 22 x 50 mm 23 μl Procedural recommendations: Temperature and buffer concentration (stringency) of hybridization...

  • Page 12: Warnings And Precautions

    Kreatech FISH probes 3. Water bath with accurate temperature from 37 °C to 90 °C 4. Plastic or glass Coplin jar 5. Variable micropipettes (1 μl - 200 μl) 6. Fluorescence microscope equipped with suitable filters (see recommendations for fluorescence microscopy) Warnings and precautions: 1.
  • Page 13 Kreatech FISH probes FISH Procedure 2 Instructions for use Cell Preparations Using Kreatech FISH probes Fluorescent in situ hybridization (FISH) is used to identify, or label, target genomic sequences so that their location can be studied. DNA sequences from appropriate, chromosome specific probes are first labeled with reporter molecules.
  • Page 14 Kreatech FISH probes As an alternative the following protocols can also be used: Pretreatment: Protocol I (standard protocol, if not satisfactory use protocol II) 1. To age the slides, bake the slides for 10 minutes (min) at 80 °C, then allow slides to cool down to room temperature (RT).
  • Page 15 Briefly spin down probe vial, vortex probe vial and briefly spin down again before use. Allow probe to reach RT before use. Research Use Only (RUO) Kreatech FISH probes are supplied Ready to-Use (RtU). Centromere, Subtelomere and Whole chromosome FISH probes are provided in 5 x concentrated formats and must be diluted with the provided hybridization buffer and/or other concentrated probes.
  • Page 16 Kreatech FISH probes 4. Place up to 14 slides in 200 ml of pre-warmed Wash Buffer I (0.4 x SSC / 0.3% Igepal) (LK-102A), incubate for 2 min at 72 °C (±1 °C) without agitation. Re-use only once for a total of 28 slides.
  • Page 17 Kreatech FISH probes Troubleshooting Alternative protocol for cytology specimens: 1. Pre-warm 50 ml of 2 x SSC / 0.5% Igepal (LK-105B) in a Coplin jar to 37 °C in a water bath. Place prepared slides in the Coplin jar and incubate for 15 minutes.
  • Page 18 Kreatech FISH probes working order. I have high background or a-specific cross-hybridization when using Centromeric or Subtelomeric probes. • Increase the temperature of the stringency wash (Wash Buffer I) when washing slides. Minimum probe application: Glass cover slip size Minimum probe application 22 x 22 mm 10 μl...
  • Page 19 Kreatech FISH probes 12. 70% acetic acid (in deionized H 13. DAPI counterstain (LK-095A (0.1 μg/ml) or LK-096A (1 μg/ml)) 14. Counterstain diluent (LK-097A) 15. Formamide 16. Ethanol 100%, 85% and 70% 17. Fixogum (LK-071A) or rubber cement Material required, but not supplied: equipment: 1.
  • Page 20 Kreatech FISH probes...
  • Page 21 Ce protocole est développé pour la de recherche uniquement (RUO) Kreatech FISH probes . Pour des résultats optimaux sur les coupes tissulaires incluses dans la paraffine, nous vous conseillons d'utiliser les kits de pré-traitement complets Kreatech (Réf.

  • Page 22: Traitement Des Lames

    Kreatech FISH probes Sinon, vous pouvez également utiliser les protocoles suivants : Traitement des lames : 1. Montez des coupes de tissus de 4 - 6 μm, fixées au formol et incluses dans la paraffine (FFPE), sur des lames chargées positivement.
  • Page 23 Kreatech FISH probes 7. Placez les lames dans de dH O, puis faites incuber pendant 1 min à TA. 8. Placez les lames dans 1 x PBS (pH 7,4) ou dans 2 x SSC (pH 7,0), puis faites incuber pendant 5 min à TA.
  • Page 24 Kreatech FISH probes Préparation de la sonde : Avant utilisation, centrifuger rapidement le tube contenant la sonde, puis passer le brièvement au Vortex et centrifuger de nouveau rapi- dement le tube. Laissez la sonde parvenir à TA avant utilisation. Les sondes Kreatech FISH sont réservées à la recherche uniquement (RUO) et sont fournies prêtes à...
  • Page 25 Kreatech FISH probes puis faites incuber pendant 2 min à 72 °C (±1 °C) sans agiter. À réutiliser une seule fois pour un total de 28 lames. 5. Placez 14 lames maximum dans 200 ml de tampon de lavage frais Wash Buffer II (2 x SSC / Igepal 0,1 %) (Réf.
  • Page 26 Kreatech FISH probes Excitation souhaitable et gamme d'émission pour les fluorophores Kreatech : Fluorophore Excitation Émission PlatinumBright™ 415 429 ±20 nm 470 ±30 nm PlatinumBright™ 495 495 ±20 nm 525 ±30 nm PlatinumBright™ 550 546 ±12 nm 580 ±30 nm Evaluation de la digestion.
  • Page 27 Kreatech FISH probes Foire Aux Questions (FAQ) J'obtiens des signaux faibles, voire pas de signal du tout • Refaites l'hybridation en vous assurant, avant utilisation, que la sonde a été bien mélangée et qu'elle est à TA. • Refaites l'hybridation en vous assurant que la stringence du lavage (tampon de lavage Wash Buffer I) est à...

  • Page 28: Recommandations Concernant La Procédure

    Kreatech FISH probes Qté minimale de sonde à appliquer : Taille de la lamelle en verre Qté minimale de sonde à appliquer 22 x 22 mm 10 μl 22 x 32 mm 15 μl 22 x 50 mm 23 μl Recommandations concernant la procédure :...
  • Page 29 Kreatech FISH probes Matériel requis mais non fourni : équipement : 1. ThermoBrite (Réf. TS-01/02) ou ThermoBrite Elite (Consultez le site Internet www.LeicaBiosystems.com pour en savoir plus) 2. Incubateur à 37 °C 3. Bain-marie avec température précise de 37 °C à 90 °C 4.
  • Page 30 L'AGT cytogénétique de manuels de laboratoire. 3e éd. New York: Raven Press; 1996. Ce protocole est développé pour la recherche uniquement (RUO) Kreatech FISH probes . Pour des résultats optimaux, nous vous conseillons d'utiliser les kits de prétraitement complets Kreatech (Réf. KI-60005, KI-60006) incluant un protocole «...
  • Page 31 Kreatech FISH probes Sinon, vous pouvez également utiliser les protocoles suivants : Prétraitement : Protocole I (protocole standard - si pas suffisant, utilisez le Protocole 1. Pour vieillir les lames, faites les cuire pendant 10 minutes (min) à 80 °C, puis laissez-les refroidir à Température Ambiante (TA).
  • Page 32 Kreatech FISH probes Préparation de la sonde : Avant utilisation, centrifuger rapidement le tube contenant la sonde, puis passer le brièvement au Vortex et centrifuger de nouveau rapi- dement le tube. Laissez la sonde parvenir à TA avant utilisation. Les sondes Kreatech FISH sont réservées à la recherche uniquement (RUO) et sont fournies prêtes à...
  • Page 33 Kreatech FISH probes pendant 2 min à TA. Retirez les lamelles en les faisant glisser. À réutiliser une seule fois pour un total de 28 lames. 4. Placez 14 lames maximum dans 200 ml de tampon de lavage préchauffé Wash Buffer I (0,4 x SSC / Igepal 0,3 %) (Réf. LK-102A), puis faites incuber pendant 2 min à...

  • Page 34: Protocole Alternatif Pour Les Échantillons Cytologie

    Kreatech FISH probes Excitation souhaitable et gamme d'émission pour les fluorophores Kreatech : Fluorophore Excitation Émission PlatinumBright™ 415 429 ±20 nm 470 ±30 nm PlatinumBright™ 495 495 ±20 nm 525 ±30 nm PlatinumBright™ 550 546 ±12 nm 580 ±30 nm Protocole alternatif pour les échantillons Cytologie :...
  • Page 35 Kreatech FISH probes Foire Aux Questions (FAQ) J'obtiens des signaux faibles, voire pas de signal du tout • Refaites l'hybridation en vous assurant, avant utilisation, que la sonde a été bien mélangée et qu'elle est à TA. • Refaites l'hybridation en vous assurant que la stringence du lavage (tampon de lavage Wash Buffer I) est à...

  • Page 36: Avertissement Et Précautions

    Kreatech FISH probes Matériel requis mais non fourni : Réactifs : 1. Kit de réactif FISH (Réf. KI-60005) 2. Kit de digestion FISH (Réf. KI-60006) 3. Formaldéhyde tamponné 1 % / 1 x PBS / MgCl 20 mM 4. 1 x PBS (pH 7,4) 5.
  • Page 37 Kreatech FISH probes 1. Réservé aux professionnels. En cas d'urgence, consultez les fiches FDS pour prendre connaissance des informations liées à la sécurité. 2. Les sondes ADN et les tampons d'hybridation contiennent du formamide (une substance tératogène) ; ne les inhalez pas et ne les mettez pas en contact avec la peau.
  • Page 38 Kreatech FISH probes...
  • Page 39 Kreatech FISH probes Procedimento FISH 1 Instruções de uso Tecidos fixados em formalina e incluidos em parafina Utilização de sondas Kreatech FISH A hibridização in situ fluorescente (FISH) é usada para identificar ou classificar sequências genômicas alvo para que seu local possa ser estudado.

  • Page 40: Pré-Tratamento De Lâminas

    Kreatech FISH probes Os seguintes protocolos também podem ser usados como alternativa: Pré-tratamento de lâminas 1. Monte os cortes de tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina (FFPE) com espessura entre 4-6um em lâminas com carga positiva. 2. Coloque as lâminas com os cortes de tecidos FFPE em estufa por 2 horas em 80°C ou 16 horas em 56°C.
  • Page 41 Kreatech FISH probes Prosseguir com a preparação de sondas. Protocolo II (para amostras cross-linked) 1. Preaqueça 8% de tiocianato de sódio a 80 °C. 2. Faça o pré-tratamento das lâminas com 0,2 M de HCl, incube por 20 min em TA.
  • Page 42 Kreatech FISH probes e a bula específica da embalagem de sondas para detalhes sobre a diluição. Co-desnaturação: 1. Aplique 10 μl da sonda ou da preparação da sonda em 22 x 22 mm de área. 2. Cubra com lamínula de vidro e lacre com Fixogum (LK-071A) ou rubber cement, específico para a técnica.
  • Page 43 Kreatech FISH probes Contracoloração: Aplique 15 μl de contracoloração de DAPI (LK-095A (0,1 μg/ml) ou LK-096A (1 μg/ml)) e aplique a lamínula de vidro. O DAPI pode ser diluído no diluente da contracoloração (LK-097A) para obter a concentração desejada. Coloque as lâminas no escuro e aguarde 10 - 15 min para que a contracoloração possa se desenvolver.

  • Page 44: Perguntas Frequentes

    Kreatech FISH probes amostra não for digerida suficientemente. Use uma amostra fresca e reduza o tempo de digestão da proteína se a amostra tiver sido dige- rida em excesso. Protocolo alternativo para desnaturação de sonda (sonda separada e amostra de desnaturação): 1.
  • Page 45 Kreatech FISH probes Muito background • Digestão não-ideal do tecido. O tecido pouco digerido aumenta a background. Molhe a lamínula em 2 x SSC, pH 7,0 por 2 min em TA. Prolongue a digestão da proteína por 2 - 20 min. • Aumente a temperatura da lavagem de estringência (tampão de lavagem I) quando lavar as lâminas.

  • Page 46: Avisos E Precauções

    Kreatech FISH probes 6. Solução de pepsina RtU (LK-101A) 7. 1 x PBS, pH 7,4 8. 2 x SSC, pH 7,0 9. Tampão de lavagem I (0,4 x SSC / 0,3% Igepal) (LK-102A) 10. Tampão de lavagem II (2 x SSC / 0,1% Igepal) (LK-103A) 11.
  • Page 47 Kreatech FISH probes Procedimento FISH 2 Instruções de uso Preparações de células Utilização de sondas Kreatech FISH A hibridização in situ fluorescente (FISH) é usada para identificar ou classificar sequências genômicas alvo para que seu local possa ser estudado. As sequencias de DNA são marcadas com sondas moleculares específicas ao cromossomo.
  • Page 48 Kreatech FISH probes Os seguintes protocolos também podem ser usados como alternativa: Pré-tratamento: Protocolo I (protocolo padrão, se não for satisfatório use o protocolo II) 1. Para preparar as lâminas, programe as lâminas para 10 minutos (min) em 80 °C, e deixe as lâminas esfriarem a temperatura local (TA).
  • Page 49 Kreatech FISH probes Preparação de sondas Misture o conteúdo da sonda com vórtex e se assegure que o seu conteúdo está na parte de baixo para uso. Somente para uso em pesquisa (RUO), as sondas Kreatech FISH são fornecidas prontas para o uso (RTU).
  • Page 50 Kreatech FISH probes 4. Coloque até 14 lâminas em 200 ml no tampão de lavagem I preaque- cido (0,4 x SSC / 0,3% Igepal) (LK-102A), incube por 2 min em 72 °C (±1 °C) sem agitar. Você pode reutilizar o tampão apenas uma vez, totalizando 28 lâminas.
  • Page 51 Kreatech FISH probes Fluoróforos Estimulação Emissão PlatinumBright™ 415 429 ±20 nm 470 ±30 nm PlatinumBright™ 495 495 ±20 nm 525 ±30 nm PlatinumBright™ 550 546 ±12 nm 580 ±30 nm Troubleshooting Protocolo alternativo para espécimes da citologia: 1. Preaqueça 50 ml de 2 x SSC / 0,5% Igepal (LK-105B) em um frasco de coplim a 37 °C com lavagem em água.
  • Page 52 Kreatech FISH probes Perguntas frequentes Sinais fracos ou inexistentes • Hibridize novamente e certifique-se de que a sonda tenha sido misturada corretamente e de que esteja em TA antes do uso. • Hibridize novamente e certifique-se de que a lavagem de estrin- gência (tampão de lavagem I)esteja na temperatura correta...
  • Page 53 Kreatech FISH probes Materiais necessários, mas não fornecidos: reagentes: 1. Kit de reagentes FISH (KI-60005) 2. Kit de assimilação FISH (KI-60006) 3. 1% de formaldeído tamponado / 1 x PBS / 20 mM MgCl 4. 1 x PBS, pH 7,4 5.
  • Page 54 Kreatech FISH probes mida, um teratógeno; não inale nem permita o contato com a pele. Use luvas e jaleco de laboratório quando manusear sondas de DNA e contracoloração de DAPI. 3. Todos os materiais devem ser descartados de acordo com as nor- mas de sua instituição para a eliminação de resíduos hospitalares.
  • Page 55 Kreatech FISH probes NOTES...
  • Page 56 Kreatech FISH probes NOTES...
  • Page 57 Kreatech FISH probes NOTES...
  • Page 58 DYOMICS GmbH. US and Inter- national patents pending for Janssen Diagnostics, LLC REPEAT-FREE™ technology. Kreatech FISH Probes. The ULS™ technology and products are covered by one or more of the following US patents 5,580,990; 5,714,327; 5,985,566; 6,133,038; US RE 40,557E, 6,797,818;...

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