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Utilisation
5.8
Assistant de protocole
Calculer la température d'anne-
lage
Principe de calcul
44
L'assistant de protocole est un outil utile pour la création automatique de programmes
PCR.
L'assistant vous permet de calculer la température d'annelage optimale pour de nou-
¡
velles paires d'amorce.
¡
Vous pouvez déterminer le temps de maintien pour l'étape d'élongation à l'aide de la
longueur de produit attendue.
L'assistant de protocole crée des programmes PCR sur la base de modèles de programme
spécifiques à la polymérase. Le logiciel peut enregistrer des modèles de programmes
pour 8 polymérases. Le logiciel contient des modèles de programmes pour des polymé-
rases de la société IST Innuscreen GmbH, un partenaire fidèle de Analytik Jena.
L'assistant de protocole propose des programmes PCR à deux ou trois étapes. Un pro-
gramme en trois étapes est composé d'étapes séparées pour :
¡
Dénaturation
Annelage (fixation des amorces)
¡
Extension ou élongation (élongation du brin)
¡
Dans un programme à deux étapes, les étapes d'annelage et d'extension sont regrou-
pées. Dans les programmes à deux étapes, utilisez la température d'annelage des
amorces T
pour l'étape qui regroupe l'annelage et l'extension.
a
En général, la température d'annelage optimale (T
rature de fusion moyenne des paires d'amorces (T
¡
Si vous connaissez la température de fusion moyenne des amorces, vous pouvez cal-
culer T
et la saisir dans le programme PCR en tant que température de l'étape d'an-
a
nelage.
Ce qui suit s'applique : T
¡
L'assistant peut également calculer les valeurs T
bases pour l'amorce sens et l'amorce antisens. Ainsi vous pouvez prendre en compte
la concentration des amorces et des sels dans le calcul. Après l'enregistrement, re-
prenez simplement la température d'annelage calculée dans le programme PCR.
Avec un thermocycleur à gradient, vous pouvez vérifier et optimiser davantage en-
¡
core la température d'annelage théorique avec un programme de gradient.
Pour les séquences courtes ≤14 nucléotides :
le logiciel calcule la température d'annelage des amorces (T
amorces T
comme suit :
m
¡
le logiciel calcule la température de fusion pour chaque amorce avec l'équation de
Wallace et al. :
T
= ((w*A + x*T)*2) + ((y*G + z*C)*4)
m
Ici, w, x, y et z correspondent au nombre de bases A, T, G et C dans la séquence
d'amorces.
¡
La valeur T
moyenne est calculée à partir des valeurs T
m
¡
La température d'annelage T
règles suivantes :
Si la différence entre les valeurs T
Si la différence entre les valeurs T
2 °C.
Pour les séquences d'amorces longues de >14 nucléotides :
Le logiciel calcule la température d'annelage des amorces (T
thode des plus proches voisins selon SantaLucia et d'Ahsen et. al..
) se situe environ 5 °C sous la tempé-
a
).
m
= T
– 5 °C
a
m
a
est calculée à partir de la valeur T
a
≤4 °C alors : T
m
>4 °C alors : T
m
Biometra TRIO
et T
à l'aide de la séquence de
m
) à l'aide des valeurs des
a
pour les deux amorces.
m
moyenne selon les
m
= T
– 5 °C
a
m
est la valeur T
la plus basse plus
a
m
) en s'appuyant sur la mé-
a
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