Manuels Connexes pour Leica TCS SP5
Sommaire des Matières pour Leica TCS SP5
- Page 1 Manuel d’utilisation du microscope confocal Leica TCS SP5 de l'IAL P. L. - 04-2016...
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Page 2: Hygiène & Sécurité
1- Sécurité, Hygiène & Ergonomie 1-1 Les sources de lumière Le système confocal SP5 utilise des sources de lumière délivrant des éclairements intenses. Il est donc important de se comporter avec prudence à l'égard de ces sources lumineuses. Le microscope utilise une source de lumière UV-Visible basée sur une ampoule à haute-pression de type Metal-Halide. -
Page 3: Caractéristiques Importantes Du Système
2 – Caractéristiques importantes du système 2-1 Le microscope Le microscope confocal Leica de type SP5-AOBS est installé sur un microscope inversé DMI6000 entière- ment motorisé et piloté par informatique. 2-1-1 Les objectifs 10x / 0,30 HCX PL FLUOTAR Dry (11506505) –... - Page 4 40x / 0,75 HCX PL Fluotar Dry (11506144) (en test - ne restera peut-être pas sur le système) – Lamelle couvre objet 0,17mm obligatoire – Sans immersion – Dist. de travail : 0,40mm – Champ maximal : 387,5x387,5µm – Longueur d'onde Résolution xy max.
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Page 5: Le Condenseur
L'ensemble du statif est placé dans un incubateur avec régulation de température et circulation de CO2. 2-1-4 L'excitation de fluorescence Elle est assurée par une source de lumière fibrée Leica EL 6000 dont les principaux avantages sont : pas d'alignement nécessaire •... - Page 6 Vitesses d'acquisition : 10Hz =10 lignes par seconde) – 100Hz – 200Hz – 400Hz (défaut – zoom min 1) – 700Hz (zoom min 2,5) – 1000Hz (zoom min 2,5) - jusqu'à 1400Hz (zoom min 6) Vue schématique du système confocal (sur un microscope droit) Dispositif de détection spectrale...
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Page 7: Le Plan Expérimental
3 - Le plan expérimental Les caractéristiques énumérées dans le chapitre précédent sont destinées à faciliter l'élaboration d'un plan expérimental. 3-1 Choix de l'objectif : Il faut faire particulièrement attention à la résolution maximale ; est-elle compatible avec le questionnement ? Si on travaille sur des objets épais, il faut faire également attention à... -
Page 8: Choix De L'échantillonnage Spatial
3-4 Choix de l’échantillonnage spatial Il faut savoir à quelle fin sont destinées les images : documents de travail, documents destinés à l'analyse ou documents pour publication, et, en fonction, adapter la qualité d'imagerie (le temps d'acquisition). C'est là qu'intervient le triangle des frustrations : la résolution ne peut être obtenue qu'au détriment de la vitesse et de la sensibilité, la sensibilité... -
Page 9: Utilisation Du Microscope Dmi 6000B
4 - Utilisation du microscope à fluorescence DMI 6000B Le statif DMI6000B est entièrement motorisé. Il est mis en route avec l'ensemble du système confocal. 4-1 Description des commandes Les commandes positionnées sur le statif sont : - sur le coté gauche ... -
Page 10: La Troisième Ligne
Z↑ Z↓ Le bouton SET + enregistre la position de mise au point - SET + enregistre la position basse Z↓ Le bouton déplace l'objectif en position basse Chg Obj change l'objectif dans le sens des aiguilles d'une montre Le bouton ... -
Page 11: Réglages Du Microscope
4-2 Réglages du microscope Réglage des oculaires – Ce réglage est indispensable avant toute utilisation prolongée du microscope. Après avoir soigneusement nettoyé les oculaires à l'alcool (voir Hygiène & Sécurité) : 1 – régler l'écartement des oculaires ; 2 – mettre les deux oculaires en position neutre. Pour cela tourner le manchon mobile de chaque oculaire de manière à... -
Page 12: Mise En Marche Du Système
5 - Mise en marche du système 1 – Sur le panneau de commande situé à droite sous le plan de travail de la station informatique, allumer le bouton – "PC/Microscope". Le microscope se met en marche et l'ordinateur s'initialise. Attendre que s'affiche la fenêtre de login. -
Page 13: Configuration Du Système
6 - Configuration du système L'interface utilisateur s'ouvre sur deux fenêtres contiguës. A gauche un ensemble de panneaux destinés à définir la configuration, à paramétrer les acquisitions, à paramétrer les traitements des images et à quantifier. A droite une fenêtre d'affichage des images. 6-1 Choix et allumage des lasers Cliquer sur l'onglet "Configuration"... -
Page 14: Deuxième Méthode
La solution la plus simple consiste à ouvrir la fenêtre "Load/Save single setting" située dans le panneau de droite "Beam Path Settings" et à utiliser une des configurations pré-enregistrées par Leica, ou celle que vous aurez vous même enregistrée dans les "User Settings" lors d'une précédente séance de travail (voir p.23) et qui apparaîtra alors dans la liste déroulante ci-contre sous la rubrique "User Settings". -
Page 15: Troisième Méthode
6-5-3 Troisième méthode Pour créer une nouvelle configuration, il peut être intéressant de repartir d'une configuration existante et de la modifier en ajoutant (ou supprimant) un ou plusieurs canaux en suivant le paramétrage expliqué ci- dessous dans la quatrième méthode. 6-5-4 Quatrième méthode On peut créer une toute nouvelle configuration en définissant tous les paramètres. -
Page 16: Séquentiel
Puis dans la case située au dessus choisir le mode de contraste : – Scan-BF → image en lumière transmise conventionnelle ; Scan-DIC → image en contraste interférentiel de Nomarski ; Scan-DIC Pol → non disponible sur le système. 6-5-6 et configuration de l'AOBS En cliquant sur AOBS, une fenêtre s'ouvre avec pour les différentes excitations programmées les options choisies : Fluorescence, Reflection et Enhanced dynamics. -
Page 17: Choix De La Vitesse De Scan
- la dynamique de l'image est de 8bits (256 niveaux de gris). Ces paramètres sont à réserver pour des images de travail qui seront difficilement exploitables pour une publication. Comme cela a déjà été expliqué plus haut dans le chapitre concernant le plan expérimental, pour une publication, il faut toujours opter pour une définition d'image supérieure ou égale au 1024x1024. -
Page 18: D'accumulation
Fréquence temps de scan temps d'accumulation zoom /ligne en s min (µs) imposé 10Hz 84,9 49,7 100Hz 0,01 8,49 4,97 200hz 0,05 4,24 2,48 400hz 0,025 2,12 1,24 700hz 0,0014 1,21 0,71 2,5x 800Hz 0,00125 1,06 0,62 2,5x 1000Hz 0,001 0,849 0,497 2,5x... -
Page 19: Réglages De L'acquisition
7 - Réglages de l'acquisition On peut maintenant régler l'excitation et la détection du ou des canaux qui ont été configurés précédemment. 7-1 En mode simultané Il faut tout d'abord aller dans le panneau de droite et vérifier la puissance des différentes raies lasers utilisées pour l'excitation. -
Page 20: En Mode Séquentiel
apparaître une surface verte pointillée de noir dans toutes les régions de l'image où se trouvent des structures. Le vert peut être uniforme si on est en dehors de toute structure. Dans un second temps ré-augmenter le gain de telle manière qu'il n'y ait pas de grande surface bleue dans l'image. -
Page 21: Rotation
- On peut obtenir le même résultat en utilisant le bouton Zoom du "Panel box". Là encore le zoom sera centré et il pourra être déplacé de la même manière que précédemment. - Enfin, on peut activer la case à cocher "Zoom in". Dans la zone image, il faut alors dessiner un cadre autour de la région d'intérêt. -
Page 22: Acquisition Des Images
8 – Acquisition des images 8-1 Plan unique Il suffit de cliquer sur la touche "Start" située dans la barre inférieure. Note : en mode simultané on obtient le même résultat avec la touche "Capture image". Par contre en mode séquentiel cette touche ne permet d'acquérir que l'image du canal actif. Si l'image comporte plusieurs canaux, chaque canal apparaît dans le carré... -
Page 23: Compensation
8-2 Série en z 8-2-1 Définir les limites Ouvrir le panneau "Z-Stack". Note - En mode multi-canal séquentiel, choisir de préférence le fluorochrome le plus stable ou celui qui va englober le plus largement les structures (de ce point de vue le canal Dapi/Hoechst n'est généralement pas approprié). -
Page 24: Réglage De L'échantillonnage En Z
8-2-3 Réglage de l'échantillonnage en z Pour cela il existe plusieurs possibilités. Première méthode - D'abord se reporter à la deuxième fenêtre où, si la case "Pinhole" est cochée, apparaît en rouge l'épaisseur des coupes optiques en fonction du paramétrage adopté. En divisant cette valeur par 2,3 (ou au moins par 2) on obtient la valeur du pas d'échantillonnage ou "z-step size". -
Page 25: Visualisation Rapide D'une Série Z
8-2-5 Visualisation rapide d'une série z On dispose de plusieurs modes de visualisation des séries z. En premier lieu on peut faire défiler successivement les images de la série en activant la touche ►. Les images défilent une fois de la première à la dernière. Si la case est activée, le défilement persiste en continu toujours de la première... -
Page 26: Acquisition D'une Série Xzy
8-2-6 Acquisition d'une série xzy Une autre possibilité pour obtenir des coupes xz - Sélectionner le mode XZY, puis en "Live" faire la mise au point sur le plan le plus intense et réaliser les réglages. - Toujours en mode "Live" positionner la ligne blanche pointillée au niveau désiré... -
Page 27: Imagerie Spectrale
8-4 Imagerie spectrale Le système de détection du SP5 est composé d'un prisme qui disperse la lumière d'émission laquelle est ensuite dirigée sur une (ou plusieurs) fenêtre dont la largeur est ajustée par motorisation. C'est ce qui permet de définir le domaine "spectrale" d'émission imagé dans les techniques précédentes. Mais cette motorisation permet également de réaliser un balayage de fente, c'est à... - Page 28 En augmentant le nombre de voxels pris en compte, cela permet d'obtenir un spectre "moyenné" plus représentatif spectre d'émission. Cependant, il ne faut pas non plus que la ROI soit trop grande car elle risque alors d'intégrer plusieurs composantes spectrales. spectre affiché...
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Page 29: D'autofluorescence
Dans le panneau de gauche de la fenêtre "Spectral Dye Separation", sélectionner les différents spectres présents dans l'image. Il peut s'agir de spectres de référence de la base Leica ou de spectres acquis par l'utilisateur. On peut ajouter plus de deux spectres en cliquant sur Add. -
Page 30: Acquisition D'une Mosaïque D'images - "Tile-Scan
8-5 Acquisition d'une mosaïque d'images - "Tile-Scan" En tout premier lieu il faut avoir initialisé la platine lors du lancement du logiciel (voir chapitre 5 alinéa 8 – p.13) : lors du démarrage du système répondre Yes à la seconde question : "Initialize Stage : DMI6000 Stage ?"... -
Page 31: Mosaïque
Dans le champ de prévisualisation apparaît un ligne de référence en pointillés. À l'aide de la souris, la déplacer en bordure du point repéré précédemment. Zoomer éventuellement en vérifiant bien que le point caractéristique reste visible. Puis à l'aide du joystick "smartmove" réaliser de petites translations suivant l'axe x en mode fin. -
Page 32: Imager Des Positions Multiples "Mark & Find
Enfin, avant de lancer l'acquisition, il faut choisir si la mosaïque doit être sauvegardée dans son ensemble comme une seule image ou comme une série d'images de chaque champ. Dans la première option, il faut cocher la case "Merge Images" et, dans ce cas, il est conseillé de cocher les cases "Auto-Stitching"... -
Page 33: Les Fonctions Autofocus
9 – Les fonctions autofocus Le système est équipé d'un dispositif d'autofocus digital "Best Focus" qui peut être activé en cliquant sur la touche dans le panneau "Acquisition Mode". Attention n'activer cette touche qu'en connaissance de cause car cela peut avoir des conséquences fâcheuses pour la préparation et les objectifs ! La fenêtre "Autofocus : Best Focus"... -
Page 34: 10- Quelques Outils
De même, si le système a été configuré en mode "Mark & Find", en cliquant sur le bouton on ouvre la fenêtre suivante. Dans l'option "First position only", la recherche de focus n'est réalisée qu'une seule fois à la première position. Dans l'option "Every position", la recherche est effectuée après chaque positionnement. -
Page 35: Baseline
Dans l'option "Strong" c'est l'axe du nuage qui va être amené à coïncider avec l'axe correspondant. De ce fait cette option peut conduire à une perte d'information d'où l'intérêt du preview pour tester l'effet de ce traitement. Pour plus détails consulter lien suivant : https://www.leica- microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica%20TCS%20SP5%20II/Application %20Notes/Dye%20Finder-AppLetter_30.EN.pdf... -
Page 36: Channel
Le système affiche automatiquement le nombre de fluorochromes imagés dans la fenêtre "Fluorescent Dyes" → ne pas modifier ! Choisir la méthode de séparation : "Weak" ou "Strong" selon que le crosstalk est faible ou fort. Dans le panneau "Rescale", choisir la méthode de ré-échantillonnage de l'image (voir p.30). -
Page 37: Enregistrement De La Session
Ne pas travailler sur cette copie. Les dossiers sont enregistrés au format .lif (leica image file). Ce format est à utiliser pour les sauvegardes car il permet de récupérer tous les paramètres des acquisitions. -
Page 38: Arrêt De La Machine
13 - Arrêt de la machine S'il y a un utilisateur de programmé sur le planning dans les 2 heures suivantes, procéder à une mise en attente du système. - 1 – Dans le panneau de configuration mettre le laser Argon à 0 mais ne pas décocher les différents lasers ne pas tourner la clé... -
Page 39: A1 - Confocal En Réflexion
A1 – Confocal en réflexion type microscopie plutôt Patte de coléoptère – 10x/0,3 anecdotique pour des biologistes cellu- – réflexion à 488nm laires mais il peut être utile d'en connaître l'existence. Dans ce mode d'imagerie on va utiliser non plus fluorescence lumière transmise) mais la lumière d'excitation... -
Page 40: A2 - Live Imaging
A2 – Live imaging... -
Page 41: A3 - Mode Enhanced
A3 – Mode Enhanced Dans le cas d'échantillons présentant un signal faible, ou nécessitant une faible excitation pour éviter des phénomènes de bleaching ou de phototoxicité, il existe un mode spécifique qui doit être activé au moment de la configuration du système. Pour cela aller dans l'onglet configuration puis cliquer sur l'icône "Settings"... -
Page 42: A4 - Ajout De Fluorochrome Dans La Dye Database
A4 – Ajout de fluorochrome dans la Dye database Il est possible de rajouter le spectre d'un fluorochrome dans la Dye database à partir de bases spectrales disponibles sur internet. Une liste de sites – non exhaustive - est indiquée ci-dessous. Il s'agit d'une procédure assez compliquée et il est vivement recommandé... -
Page 43: A5 - Milieu De Montage Vs Milieu D'immersion
Safe Mount 1,49-1,5 Bio Mount HM Huile de cèdre 1,515 immersion Huile Zeiss 1,515 huile Huile N (Leica) 1,518 CFM3 Citifluor 1,518 Huile F (Leica) 1,52 CFM 1 / CFM 2 1,52 ... -
Page 44: Table Des Matières
Table des Matières 1 – Hygiène & Sécurité 8-2-4 Acquisition d'une série z 1-1 Les sources de lumière 8-2-5 Visualisation rapide d'une série z 1-2 Le nettoyage des oculaires 8-2-6 Acquisition d'une série xzy 1-3 Le nettoyage de la platine 8-3 Acquisition de série temporelles 1-4 Le réglage des oculaires - "Time Lapse"...