Leica TCS SP5 X Manuel D'utilisation
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Version : 01/2013
Plate-forme d'imagerie de l'INMED
M
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SP5 X
Page 1/51
ANUEL D
UTILISATION
MANUEL D'UTILISATION
DU MICROSCOPE CONFOCAL
LEICA TCS SP5 X
François MICHEL PhD

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Manuels Connexes pour Leica TCS SP5 X

Sommaire des Matières pour Leica TCS SP5 X

  • Page 1 Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 1/51 ANUEL D UTILISATION MANUEL D’UTILISATION DU MICROSCOPE CONFOCAL LEICA TCS SP5 X François MICHEL PhD...
  • Page 2 Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 2/51 ANUEL D UTILISATION N’hésitez pas à demander conseil aux ingénieurs de la plateforme !!! François (poste 28108) et Thomas (poste 28118). En leur absence, Agnès Baude (poste 28131) peut vous aider en cas d’urgence.

  • Page 3: Table Des Matières

    Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 3/51 ANUEL D UTILISATION DEMARRAGE ET MISE EN MARCHE DU SYSTEME STARTING THE SYSTEM LANCEMENT DU LOGICIEL LAS AF PRESENTATION DE LA PARTIE DE PARAMETRAGE DE L’ACQUISITION CHOIX ET CREATION D’UNE CONFIGURATION PRESENTATION DU STATIF DM6000B ACQUERIR UNE IMAGE ACQUERIR UNE SERIE EN Z...

  • Page 4: Demarrage Et Mise En Marche Du Systeme

    Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 4/51 ANUEL D UTILISATION DEMARRAGE ET MISE EN MARCHE DU SYSTEME Allumer la lampe à fluorescence et vérifier le niveau d’illumination (des détails sur la lampe en annexe A). Au niveau du poste de commande : 1.

  • Page 5: Starting The System

    Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 5/51 ANUEL D UTILISATION STARTING THE SYSTEM Turn on the fluorescent lamp and check the illumination level 2- Start the TCS workstation (green button “PC microscope”). The system starts automatically.

  • Page 6: Lancement Du Logiciel Las Af

    Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 6/51 ANUEL D UTILISATION LANCEMENT DU LOGICIEL LAS AF Démarrer le logiciel en cliquant sur l’icône LAS AF sur le bureau. Assurez-vous que la platine soit baissée au maximum (Lower Z). 1.
  • Page 7 Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 7/51 ANUEL D UTILISATION Le logiciel LAS AF se répartit en deux parties : la gauche dédiée aux réglages des acquisitions, celle de droite dédiée à l’affichage des images. Mettre en marche les lasers : Dans le menu Configuration →...
  • Page 8 Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 8/51 ANUEL D UTILISATION Le laser Blanc (White Ligth Laser) est un laser pulsé picoseconde (<0,5 W), la clé sur le boitier d’alimentation doit toujours être sur ON (ne pas toucher le boitier à gauche du statif). L’étalement spectral vient d’effets d’optique non linéaire dans le passage du faisceau pulsé...

  • Page 9: Presentation De La Partie De Parametrage De L'acquisition

    Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 9/51 ANUEL D UTILISATION PRESENTATION DE LA PARTIE DE PARAMETRAGE DE L’ACQUISITION 1. Accès aux menus principaux dont Acquire 2. Différents modes d’acquisition (XYZ, XZY, XYT, XYλ, …). Le mode par défaut est XYZ. Icône d’activation des modes séquentiel / mosaïque / mark &...

  • Page 10: Choix Et Creation D'une Configuration

    Il vous suffit d’utiliser le menu déroulant Load/Save single settings et de sélectionner une configuration dans la liste. Elle contient des configurations usine de Leica mais aussi celles sauvées par les utilisateurs (user settings): ne pas changer ces configurations, créez la votre et sauvez la : prénom + descriptif...
  • Page 11 Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 11/51 ANUEL D UTILISATION 4. Activer l’AOTF puis le nombre de raies laser dont vous avez besoin. 5. Activer les raies laser puis régler la longueur d’onde, pour plus de précision double cliquer sur le chiffre pour taper la valeur exacte.
  • Page 12 Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 12/51 ANUEL D UTILISATION ETECTION 1. Activer les détecteurs dont vous avez besoin (Hybrides (voir annexe B4) ou PMT classique). A titre d’information, on peu choisir dans la liste déroulante, de faire apparaître le spectre d’émission de votre fluorochrome.
  • Page 13 Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 13/51 ANUEL D UTILISATION 5. Régler le gain et l’offset par un clic sur le nom du détecteur ou grâce au control panel (voir page suivante). NB : Les détecteurs Hybrides n’ont pas d’offset et la plage de travail est comprise entre 10 et 500%.
  • Page 14 Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 14/51 ANUEL D UTILISATION CONFIGURATION DES BOUTONS DE REGLAGE (control panel) La fonction ainsi que la valeur associée est affichée au dessus de chaque bouton du control panel. Pour chaque bouton, vous pouvez modifier sa fonction et sa sensibilité. Les deux petits boutons noirs à...
  • Page 15 Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 15/51 ANUEL D UTILISATION Sélectionner le bouton à modifier(1) puis choisir dans les 2 menus déroulants la fonction (2) et la sensibilité à appliquer (3). Vous pouvez enregistrer votre panel de boutons : cliquez sur Save (4) et donnez un nom à votre panel.

  • Page 16: Presentation Du Statif Dm6000B

    Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 16/51 ANUEL D UTILISATION PRESENTATION DU STATIF DM6000B Le statif DM6000B est entièrement motorisé. UR LE COTE GAUCHE 1- Changement d’objectif : Appuyer sur le bouton du haut pour un passage vers un grossissement supérieur, sur le bouton du bas pour un passage vers un grossissement inférieur.
  • Page 17 Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 17/51 ANUEL D UTILISATION UR LE COTE DROIT 1- Mise au point électronique. Monte/descend l’objectif jusqu’aux butées hautes (focus) et basses (Lower Z) programmées. 2- Shutter Fluo. 3- Réglage de l’orientation de l’analyseur pour le DIC et l’illumination polarisée : écran de contrôle digitale N FAÇADE Home...
  • Page 18 Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 18/51 ANUEL D UTILISATION Illumination Transmission Fluorescence En transmission : exemple contraste interférentiel différentiel (DIC) avec contrôle du prisme, et du shutter. Fonctionnel avec les objectifs 20 X et plus. En Fluorescence (voir annexe A) : choix du cube UV GFP RED (RFP et rouge profond) et shutter Objectifs Sec : 5 –...
  • Page 19 Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 19/51 ANUEL D UTILISATION Platine motorisée Ne pas changer les réglages en Z. On peut garder en mémoire jusqu’à 6 positions en XY (indépendamment du logiciel), attention le rectangle blanc est sensible : si on touche l’écran, la platine se déplace pour centrer le point de contact ! 4.

  • Page 20: Acquerir Une Image

    Disposer la lame sur le microscope, faire la mise au point sur le statif ou au joystick et choisir un champ. Sélectionner une configuration Leica ou User dans la liste des configurations. Lancer une acquisition continue (preview) en cliquant sur le bouton Live (en bas à gauche).

  • Page 21: Acquerir Une Serie En Z

    Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 21/51 ANUEL D UTILISATION ACQUERIR UNE SERIE EN Z (plusieurs plans, une seule couleur) Disposer la lame sur le microscope, faire la mise au point et choisir un champ. Procéder de la même façon que dans le paragraphe Acquérir une image (un seul plan, une seule couleur) pour faire les réglages, en prenant soin de les réaliser dans le plan le plus intense.
  • Page 22 Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 22/51 ANUEL D UTILISATION OMPENSATION Il est possible de compenser la perte de signal avec la profondeur par une augmentation linéaire et automatique du gain des détecteurs et/ou du laser entre les bornes du stack et éventuellement plusieurs positions dans le stack.

  • Page 23: Acquerir Une Serie En Xz

    Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 23/51 ANUEL D UTILISATION ACQUERIR UNE SERIE EN XZ (un ou plusieurs plans perpendiculaires) Disposer la lame sur le microscope, faire la mise au point et choisir un champ. Sélectionnez le mode d’acquisition en XZY 2.

  • Page 24: Echantillonnage Spatial

    Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 24/51 ANUEL D UTILISATION ECHANTILLONNAGE SPATIAL  Echantillonnage latéral XY : Pour que vos images soient bien échantillonnées, la taille du pixel de l’image doit être égale à moins de la moitié de la résolution en XY de l’objectif utilisé (critère de Nyquist). Par exemple au 63x, la résolution latérale de l’objectif est de 140 nm (théorique, dans la pratique ajouter au moins 50 % de la valeur soit +/- 250 nm dans notre cas).
  • Page 25 Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 25/51 ANUEL D UTILISATION  Echantillonnage axial : De la même façon, lorsque vous effectuez une série Z, l’intervalle entre 2 coupes optiques doit être fixé en fonction de la résolution axiale de l’objectif. Selon le critère de Nyquist, l’intervalle doit être inférieur ou égal à...

  • Page 26: Acquerir Plusieurs Marquages Simultannement

    Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 26/51 ANUEL D UTILISATION ACQUERIR PLUSIEURS MARQUAGES SIMULTANNEMENT (avec ou sans serie Z) Disposer la lame sur le microscope, faire la mise au point et choisir un champ. Passer en mode Scan en lançant une acquisition en cliquant sur le bouton Live. 1.
  • Page 27 Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 27/51 ANUEL D UTILISATION Attention à vérifier les éventuels débordements de fluorescence d’un canal dans l’autre : Exemple d’un co-marquage GFP + DsRed : Excitation à 488 nm (pour la GFP) et à 560 nm (pour la DsRed), acquisition de l’image de la GFP dans le détecteur HyB1 et de l’image du DsRed dans le HyB3 (ou le PMT2 si 3 couleurs).

  • Page 28: Acquerir Plusieurs Marquages Sequentiellement

    Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 28/51 ANUEL D UTILISATION ACQUERIR PLUSIEURS MARQUAGES SEQUENTIELLEMENT (Avec ou sans série Z) Disposer la lame sur le microscope, faire la mise au point et choisir un champ. Créer une configuration pour une acquisition simultanée avec plusieurs longueurs d’onde d’excitation (voir précédent).
  • Page 29 Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 29/51 ANUEL D UTILISATION Choisir le mode d’acquisition le plus approprié entre les modes suivant : - Between lines : pour acquérir une ligne avec une configuration, puis la même ligne avec une autre configuration avant de passer à...

  • Page 30: Acquerir Plusieurs Positions De Platine : Mark & Find

    Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 30/51 ANUEL D UTILISATION ACQUERIR PLUSIEURS POSITIONS DE PLATINE : Mark & Find N.B : La platine XY motorisée doit être initialisée au lancement du logiciel pour pouvoir effectuer ce type d’acquisition (voir p 6). Cliquer sur l’icône «...

  • Page 31: Acquerir Une Mosaique D'images

    Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 31/51 ANUEL D UTILISATION ACQUERIR UNE MOSAIQUE D’IMAGES ERIFICATION DE LA PLATINE XY Avant de réaliser une acquisition d’image mosaïque, il est nécessaire de vérifier l’orientation de la platine XY afin que son déplacement soit correct et la reconstitution de l’image soit bonne. Avec ces vérifications, l’image obtenue est dans la même orientation que celle visualisée dans les oculaires.
  • Page 32 Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 32/51 ANUEL D UTILISATION Activer Flip X dans Configuration / Setting / Image orientation CQUISITION L’acquisition d’une image mosaïque se fait en enregistrant la position du coin « inférieur droit » puis la position du coin «...

  • Page 33: Acquerir Des Images En Illumin Ation Transmise

    Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 33/51 ANUEL D UTILISATION ACQUERIR DES IMAGES EN ILLUMIN ATION TRANSMISE Faire la mise au point sur votre échantillon Vérifier le sélecteur à l’arrière du statif (seule partie non motorisée de ce microscope), il y a deux positions : i) Vers l’avant, comme sur la photo où...

  • Page 34: Acquisition De Series D'images Spectrales

    PECTRE D EMISSION Le système de détection Leica basé sur un étalement spectrale et une sélection par fentes motorisées (voir annexe B3) permet l’obtention de spectres d’émission par balayage de la fente (la largeur de la fente minimale est de 5 nm donc le pas de scan efficace minimum est de 3 nm).
  • Page 35 Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 35/51 ANUEL D UTILISATION Au niveau de l’onglet λ-Scan Range Properties, sélectionner le détecteur à utiliser (1) Indiquer également (2): - les valeurs de début (Begin) et de fin (End) de la série Lambda - la taille de la bande passante (Band With) : largeur de la fente.
  • Page 36 Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 36/51 ANUEL D UTILISATION Le spectre de l’échantillon est représenté automatiquement. - Mettre l’échelle de l’axe Y en mode Normalize (clic droit sur l’axe, Scaling) (3) - Déplacer la ROI sur l’image pour la placer sur une zone d’intérêt. - Augmenter la taille de la ROI en fonction de la taille de la zone d’intérêt.(plus la ROI est grande, moins le spectre sera bruité) (4) - Pour exporter les valeurs du spectre (clic droit sur le graphique/Export/Excel, un fichier .csv...
  • Page 37 Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 37/51 ANUEL D UTILISATION - Dans la liste Table of Spectra, faire un clic droit, puis New (7) - Cliquer sur Get Data Point (8). - Dans la fenêtre Text Loader, cliquer sur Browse (9) et chercher le fichier .csv qui vient d’être enregistré.
  • Page 38 Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 38/51 ANUEL D UTILISATION Le résultat de la séparation spectrale s’affiche sur l’écran de droite. Deux images sont créées : l’une représentant le marquage GFP, l’autre le marquage YFP (voir p 39) Avant séparation spectrale Après séparation spectrale...
  • Page 39 Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 39/51 ANUEL D UTILISATION ’ PECTRE D EXCITATION Le SP5-X est doté d’un laser blanc qui permet de sélectionner la longueur d’onde d’excitation au nm près. Il permet également de générer des spectres d’excitation. Sélectionner le mode Λ...

  • Page 40: Visualisation Des Images Acquises Et Control De L'affichage

    Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 40/51 ANUEL D UTILISATION VISUALISATION DES IMAGES ACQUISES ET CONTROL DE L’AFFICHAGE Sur l’écran de droite, différentes icônes vous permettent d’accéder aux différents modes de visualisation de vos images. Un double clic sur l’image d’un canal (ou le merge) donne un affichage plein écran de ce canal.

  • Page 41: Quantification De Signal

    Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 41/51 ANUEL D UTILISATION QUANTIFICATION DE SIGNAL Pour quantifier un signal de fluorescence, les différentes conditions d’expérience doivent être acquises avec les mêmes conditions de réglage (même puissance laser, même gain et Offset pour les PMTs).

  • Page 42: Enregistrement Des Images

    Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 42/51 ANUEL D UTILISATION ENREGISTREMENT DES IMAGES La fenêtre de gestion des images se trouve dans l’onglet Experiments situé sur l’écran de gauche. A chaque fois que vous effectuez une acquisition Capture image ou Start, le logiciel l’indique dans cette fenêtre.
  • Page 43 Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 43/51 ANUEL D UTILISATION Le dossier Experiment est sauvegardé sous forme de fichier en format .lif. Pour récupérer les données en format .tif, il faut les exporter. Pour cela, faire un clic droit sur le dossier à...

  • Page 44: Mise Hors Tension Du Systeme

    Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 44/51 ANUEL D UTILISATION MISE HORS TENSION DU SYSTEME Vérifier sur le planning en ligne si le système est réservé après votre session.  Si le système est réservé après votre séance ou dans les 3h qui suivent, vous ne devez pas l’éteindre complètement, mais procéder de la façon suivante : 1.

  • Page 45: Turning Off The System

    Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 45/51 ANUEL D UTILISATION TURNING OFF THE SYSTEM FIRST, PLEASE CHECK THE PLANNING ONLINE !!! If the system is used within 3 hours after your session, you do not turn it off completely, but proceed as follows: 1.
  • Page 46 Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 46/51 ANUEL D UTILISATION ANNEXE A Caractéristiques du statif : Lampe, cubes à fluorescence, objectifs. La lampe à fluorescence est une lampe Métal- Halide d’une durée de vie de 2000 h mais coûte 10 fois plus chère qu’une HBO, elle met moins de 5 minutes à...

  • Page 47: Annexe B1

    Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 47/51 ANUEL D UTILISATION ANNEXE B1 Caractéristiques de la partie confocale : excitation • Lasers diode UV-bleu (405 nm) et Argon (458, 476, 488, 514 nm) • Laser blanc (470-670 nm) : jusqu’à 8 raies simultanées séparées de 8 nm minimum, précision par raie 1 nm, puissance maximale de 1.5 (à...
  • Page 48 Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 48/51 ANUEL D UTILISATION ANNEXE B2 Caractéristiques de la partie confocale : excitation/détection La séparation de la lumière d’excitation et d’émission est basée sur l’utilisation d’un AOBS (Acousto-Optic Beam Spliter), en effet l’utilisation de miroirs dichroïques est proscrite par l’utilisation du laser blanc et des 200 longueurs d’ondes d’excitations potentielles.
  • Page 49 Version : 01/2013 Plate-forme d’imagerie de l’INMED ’ SP5 X Page 49/51 ANUEL D UTILISATION ANNEXE B3 Caractéristiques de la partie confocale : détection La lumière d’émission est détectée par trois détecteurs. Elle passe d’abord par un prisme qui va faire une ouverture spectrale.
  • Page 50 Les détecteurs HyD peuvent fonctionner sous trois régimes : Normal, Bright R et comptage de photon (voir brochure Leica pour plus de détails). Le mode Bright R induit une correction Gamma du signal qui pondère à la hausse les faibles signaux et à la baisse les forts signaux ce qui "corrige"...
  • Page 51 Sources et ressources Sur le serveur : :\Netdata\9 – Imagerie\SP5X vous pouvez trouvez les brochures Leica en pdf illustrant ou expliquant les spécificités de ce microscope on peut les trouver sur le site leica http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs- sp5-x/downloads/: Pour finir, un remerciement spécial à...

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