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Leica SP8 STED Mode D'emploi
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Leica SP8 STED Mode D'emploi

Microscope confocal
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Plateau technique d'imagerie cellulaire
d'Infinity-Purpan
Mars 2013
Mise à jour : Mars 2022
Mode d'emploi
Microscope confocal
Leica SP8 STED
Plateau technique d'imagerie cellulaire d'Infinity-Purpan
Sophie Allart - sophie.allart@inserm.fr
Simon Lachambre – simon.lachambre@inserm.fr
Tél : 05. 62. 74. 45. 78 - 05. 31. 54. 79. 01

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Manuels Connexes pour Leica SP8 STED

Sommaire des Matières pour Leica SP8 STED

  • Page 1 Mars 2013 Mise à jour : Mars 2022 Mode d'emploi Microscope confocal Leica SP8 STED Plateau technique d'imagerie cellulaire d’Infinity-Purpan Sophie Allart - sophie.allart@inserm.fr Simon Lachambre – simon.lachambre@inserm.fr Tél : 05. 62. 74. 45. 78 - 05. 31. 54. 79. 01...

  • Page 2: Table Des Matières

    Sommaire - Contents Allumage du système - System start-up Fonctionnement du statif - How the stand works Observation aux oculaires - Observation using eyepieces Contrôles manuels - Manual controllers Réglage du Köhler - Köhler adjustment Présentation du software - Software presentation Menu Acquisition - Acquisition tab Réglage excitation / émission - Excitation and emission settings Acquisition d'une image - Image acquisition...

  • Page 3: Allumage Du Système - System Start-Up

    Allumage du système - System start-up Allumer la lampe à fluorescence - Turn on the fluorescence light Allumer le contrôleur CTR6500 - Turn on the CTR6500 controller Sous le bureau, mettre en position « ON » le bouton "Scanner Power" puis "Laser power" - Under the desk, turn on the 'Scanner power' button, then the 'Laser power' button Laser Power Scanner power...
  • Page 4 Lors du démarrage du logiciel, une première fenêtre apparait - When the software starts, a first window appears : Vérifier que "STED" est "OFF" puis cliquez sur OK – Make sure that "STED" is "OFF" then click on OK button Une fois le soft allumé, activer les lasers - When the software is running, activate the lasers:...

  • Page 5: Fonctionnement Du Statif - How The Stand Works

    Fonctionnement du statif - How the stand works Observation aux oculaires - Observation using eyepieces Plusieurs objectifs sont présents sur le SP8 - Various objectives are available on the SP8 : 10x ON 0.3 DRY 20x ON 0.75 DRY 40x ON 1.25 OIL 40x ON 1.3 OIL 63x ON 1.4 OIL 100x ON 1.4 OIL : dédié...

  • Page 6: Brightfield

    Cliquer sur le bouton avec l’icône d’un œil pour voir aux oculaires - Click on the button with the eye symbol to see on the eyepieces Réglage de l’intensité à l’aide des boutons « INT » - Adjust the intensity with the "INT"...

  • Page 7: Contrôles Manuels - Hand Operated Controls

    Contrôles manuels - Hand operated controls Pour vous déplacer en x, y et z, utilisez le joystick - To navigate in x, y and z, use the joystick : Déplacement en y - Move in y Déplacement en x - Move in x Déplacement en z (mise au point) - Move in z (focus)
  • Page 8 Faire la mise au point sur l'échantillon - Focus on the sample Fermer le diaphragme de champ - Close the field diaphragm (FD) Régler la hauteur du condenseur jusqu'à voir les bords du diaphragme net - Adjust the height of the condenser until the edges of the diaphragm are clearly defined. A l'aide des vis, centrer le diaphragme - With the screws, centre the diaphragm.

  • Page 9: Présentation Du Software - Software Presentation

    Présentation du software - Software presentation L'interface du logiciel LasX se divise en deux parties principales - The LasX software interface is divided into two main parts : Réglages des paramètres d'acquisition - Acquisition parameters Affichage de l'image - Image viewer Acquisition parameters Image window Plateau technique d'imagerie cellulaire d’Infinity-Purpan...

  • Page 10: Présentation Du Menu Acquisition - Acquisition Part Presentation

    Présentation du menu Acquisition - Acquisition part presentation Mode d’acquisition, de la gauche vers la droite - Acquisition mode, from left to right : Différents modes d’acquisition possible : XYZ, XYT, XYλ… Par défaut : XYZ – Various acquisition mode possible : XYZ, XYT, XYλ. By default is on XYZ. Mosaïque - Mosaic / Tiles Multiposition -...
  • Page 11 Réglage de l'excitation et l'émission - Excitation and emission settings : Laser UV - UV laser Laser visible - Visible laser Objectif - Objective Fenêtre de détection - Emission window Choix du détecteurs (PMT, HyD) - Detectors choice (PMT, HyD) Plateau technique d'imagerie cellulaire d’Infinity-Purpan Sophie Allart - sophie.allart@inserm.fr Simon Lachambre –...

  • Page 12: Acquisition D'une Image - Image Acquisition

    Acquisition d'une image - Image acquisition Charger une configuration - Load a predefined configuration Dans Acquisition Mode, cliquez sur le bouton Seq - In Acquisition Mode, click on the Seq button Un nouvel onglet apparaît : Sequential Scan - A new tab appears: Sequential Scan Cliquez sur le bouton Load - Click on the "Load"...

  • Page 13: Récupérer Les Réglages De Son Image - Retrieve The Settings Of

    Charger une configuration - Load a configuration Récupérer les réglages de son image - Retrieve the settings of your image Cliquez sur l'onglet "Open projects" - Click on the "Open project" tab Cliquez sur le 3e icône pour ouvrir un projet - Click on the 3rd icon to open a projet Sélectionner le projet qui vous convient - Choose the project that fits your needs...

  • Page 14: Régler Les Paramètres D'acquisition - Adjust Acquisition Parameters

    Régler les paramètres d'acquisition - Adjust acquisition parameters La dynamique d'image - Image dynamic : L’image a une dynamique définie par un nombre de bits. Ce nombre équivaut au niveaux de gris (NG). Par exemple, pour 8 bits, on aura 255 NG. Zéro étant le noir et la valeur maximale étant le blanc.
  • Page 15 Puissance laser - Laser power Gain Gain Comment ajuster le gain des détecteurs - How to adjust the detector gain ? Sur les PMT - On the PMT : Inférieur à 500V: faible amplification du signal - Under 500V: low signal amplification Entre 500 et 800V : bonne gamme - Between 500V and 800V : good range Supérieur à...
  • Page 16 Comment ajuster la puissance laser - How to adjust the laser power ? La puissance se règle dans le logiciel. Il faut sélectionner la séquence correspondante dans l'onglet "Sequential scan". The power is set in the software. The corresponding sequence can be selected in the "Sequential scan"...
  • Page 17 Moyennage : correspond à la moyenne des passages du laser pour améliorer le rapport signal sur bruit. Ca permet de lisser le signal. Il peut être fait par ligne (plus rapide) ou par frame. Averaging : is the mean of the laser passes to improve the signal to noise ratio.
  • Page 18 La résolution de l'image - Image résolution : La résolution maximale théorique est définie par le théorème de Shannon-Nyquist qui dit que la taille d'un pixel doit être 2.3 fois inférieur à la valeur de résolution. Les valeurs et formules sont sur un tableau affiché...
  • Page 19 Appliquer un zoom optique - Add a optic zoom Augmenter le optic zoom : signifie que le champ d'observation sera plus petit donc des pixels plus petits pour un nombre de pixels fixe. Increasing the optic zoom: means that the field of view will be smaller thus smaller pixels, for a fixed number of pixels.
  • Page 20 Acquérir une image multicouleur - Acquire an multicolor image Faire la mise au point aux oculaires (p.3-4) - Focus the sample on the eyepieces (p.3-4) Cliquer sur le bouton 'Seq' et ouvrir autant de séquences de couleurs ou charger une configuration (p.12-13) - Click on the 'Seq' button and open as many sequences as colours OR load a predefinied configuration (p.12-13)

  • Page 21: Acquérir Une Image En Transmission - Acquire A Brighfield Image

    Acquérir une image en transmission - Acquire a brighfield image Faire la mise au point aux oculaires (p. 3-4) - Focus the sample on the eyepieces (p. 3-4) La transmission est simultanément acquise avec un canal fluo : la source laser est commune (puissance et longueur d'onde).

  • Page 22: Comparaison D'intensité - Intensity Comparison

    Comparaison d'intensité - Intensity comparison Si vous souhaitez faire une étude d'intensité sur vos images, faites d'abord vos réglages (laser, gain) sur l'échantillon le plus brillant et gardez ces paramètres pour acquérir les images suivantes. Ainsi, les autres échantillons ne seront pas saturés. De même, les améliorations d'images (contraste par exemple) doivent d'abord être faites sur l'image la plus brillante puis appliquer de la même manière sur les autres images.
  • Page 23 Se mettre en fausse couleur et chercher pour chaque canal dans le z s'il y a un plan plus lumineux que celui sur lequel les réglages ont été précédemment faits. S'il a de la saturation, ajuster les réglages - Switch to false colour and search for each channel in the z if there is a brighter plane than the one on which the settings were previously set.

  • Page 24: Pile D'images Avec Compensation - Z-Stack With Compensation

    Pile d'images avec compensation - Z-stack with compensation Cette fonction de compensation peut être utilisée lors d’une acquisition d’un Z-Stack pour compenser les variations de brillance dans l’épaisseur de l’échantillon. Ceci peut se faire de 2 façons - This compensation function can be used during a Z-Stack acquisition to adjust for brightness variations in the sample thickness.
  • Page 25 Comment faire la compensation en z - How to do a compensation in z ? Régler les paramètres d'acquisition (p.10) - Set the image parameters (p.10) Définir les bornes de la pile d'images avec "Begin" et "End" en Live (p.15) - Set the limits with 'Begin' and 'End' button in Live (p.15) Sélectionner le mode de scan : "Between Stack"-...

  • Page 26: Multipositions Et Mosaïques Multipositions And Tiles Scan

    Multipositions et mosaïques Multipositions and tiles scan Acquisition en multipositions 2D - 2D Multiposition imaging Régler les paramètres d'acquisition (p.10) - Set the image parameters (p.10) Dans Acquisition Mode, cliquez sur le 2e icône - In Acquisition Mode tab, click on the 2nd icon Se déplacer avec le joystick pour choisir une position (xy et z) - Move with the joystick to...

  • Page 27: Multiposition Combiné À Un Z-Stack - Multiposition Imaging

    Multiposition combiné à un z-stack - Multiposition imaging combined with z-stack Régler les paramètres d'acquisition (p.10) - Set the image parameters (p.10) Dans Acquisition Mode, se mettre en xyz et cliquez sur le 2e icône - In Acquisition Mode tab, check we are in xyz and click on the 2nd icon Se déplacer pour choisir une position (xy et z) - Move to select a position (xy and z) Définir les bornes du z-stack avec les boutons "Begin"...

  • Page 28: Mosaïque - Tile Scan Imaging

    Mosaïque - Tile scan imaging Régler les paramètres d'acquisition (p.10) - Set the image parameters (p.10) Dans Acquisition Mode, se mettre en xyz et cliquez sur le 1e icône - In Acquisition Mode tab, check we are in xyz and click on the 1st icon Dans l'onglet "Stage", deux possibilités - In 'Tile scan' tab, two possibilities : Définir le nombre de tuiles à...

  • Page 29: Fin De Session - End Of The Session

    Fin de session - End of the session Sauvegarde des données - Data saving Aller dans l'onglet "Open project" (p.10) - Go to "Open project" tab (p.10) Chaque image est automatiquement placées dans un "project". Elles peuvent être renommées par un clic droit dessus puis "Rename" - Each image is automatically placed in a "project".
  • Page 30 Extinction du système - System shutdown Quand vous êtes le dernier utilisateur la journée - When you are the last user of the day Nettoyer les objectifs 40x et 63x utilisés avec du Kimtech et de l'éthanol - Clean used 40x and 63x objectives with Kimtech and ethanol Baisser la tourelle d'objectif au maximum - Turn the objective turret as low as possible...
  • Page 31 Quand la fermeture du logiciel plante, ouvrir le gestionnaire de tâche - When shutting down the software does not work, open the task manager Sélectionner "Leica Application Suite X" et cliquez sur "End Task" - Select "LAS Application Software" and click on "End Task".
  • Page 32 Ne pas éteindre l'ordinateur - Do not turn off the pc Sous le bureau, tourner la clé vers la gauche. Le voyant lumineux orange s'éteint - Under the desk, turn the key to the left. The orange indicator light switches off Sous le bureau, mettre les deux interrupteurs sur OFF : Laser power PUIS Scanner power - Under the desk, turn the two buttons to OFF...

  • Page 33: Récapitulatif Des Étapes - Overview Of The Steps

    Rappels - Reminders Nettoyer les objectifs à immersion (40x et 63x) et l'insert de la platine avec du Kimtech et de l'alcool en fin de séance - Clean the immersion objectives (40x and 63x) and the stage support with Kimtech and alcohol at the end of the session Récupérer vos data sur le serveur Data_Plat dès le lendemain - Retrieve your data from the Data_Plat server the next day...
  • Page 34 Mode d'emploi Module STED...
  • Page 35 Sommaire - Contents Installation et allumage du système - System start-up and install Réglages des paramètres - Parameters settings Acquisition 2D à une couleur - 2D colour imaging Réglages - Settings Alignement du STED - STED alignment Amélioration de la déplétion - Improvement of depletion Réglage pour STED multicouleurs - Settings for multicolour STED Réglage pour STED 3D - Settings for 3D STED Charger une configuration - Load a configuration...

  • Page 36: Installation Et Allumage - Install And Ignition

    Installation et allumage - Install and ignition Positionner la sur-platine galvanométrique (posée à droite) à l'aide des deux vis noires incluses dans la sur-platine et la clé allène qui se trouve dans le tiroir haut du rack STED Turn on the system by following the process (p.1) Ne pas utiliser l'insert à...
  • Page 37 Sélectionnez l'objectif 100x sinon l'onglet STED ne sera pas activé - Select the 100x objective otherwise the STED tab will not be activated 100x objective Visser l'objectif 100x sur le revolver d'objectifs - Screw the 100x objective onto the objective revolver Allumez tous les lasers et mettre le laser STED à...

  • Page 38: Réglages Des Paramètres - Parameters Settings

    Réglage des paramètres - Parameter setting Acquisition 2D à une couleur - 2D single colour acquisition Régler les différents canaux avant de procéder à l'alignement du STED - Adjusting the different channels before aligning the STED Réglages - Settings En général on crée un canal confocal et un canal STED avec acquisition en Between Lines pour chaque couleur.
  • Page 39 Taille de l'image (format) : pour une acquisition en ligne, la taille de pixel doit être la même pour l'image confocal et pour l'image STED. La taille du pixel dépend de la puissance du STED mais aussi de ce que l'on veut observer. La résolution du STED est au mieux de 40 à...
  • Page 40 Vitesse d'acquisition et direction: Plus la vitesse d'acquisition de l'image est lente, meilleur sera le rapport signal/ bruit. La vitesse habituellement choisie est de 400 Hz. On évitera le bi-directionnel, à tester. Acquisition speed and direction: The slower the image acquisition speed, the better the signal to noise ratio.
  • Page 41 Pour les deux canaux, le shutter du laser de déplétion doit être ouvert, mais la puissance du laser de déplétion doit être sur zéro dans le canal confocal. For both channels, the depletion laser shutter must be open, but the depletion laser power must be set to zero in the confocal channel.

  • Page 42: Amélioration De La Déplétion - Improvement Of Depletion

    Amélioration de la déplétion - Improvement of depletion Réaligner le STED - Realign the STED Optimiser la puissance de déplétion - Optimising depletion power Optimiser la puissance de déplétion - Optimising depletion power Mettre un moyennage de 16 sans accumulation et lancer une acquisition - an averaging of 16 without accumulation and launch an acquisition Au cours de l'acquisition, à...

  • Page 43: Acquisition Sted Multicouleur - Multicolour Sted Acquisition

    Dans notre cas, le laser STED est pulsé lui aussi (un pulse tous les 600 psec). Or la déplétion est meilleure lorsque le fluorochrome est à l'état excité en phase de conversion interne. In our case, the STED laser is also pulsed (one pulse every 600 psec). Depletion is better when the fluorochrome is in an excited state during the internal conversion phase.
  • Page 44 Acquisition STED 3D - 3D STED imaging Résolution : au maximum on peut obtenir 50 nm en Z à 100 % du laser STED en 3D. Le meilleur compromis pour une résolution homogène en XYZ est obtenue à 65 % du STED en Z : 130 nm XYZ et 130 nm en Z.
  • Page 45 Dans Acquisition mode, on peut visualiser la PSF en fonction des paramètres lasers choisi - Acquisition mode, the PSF can be viewed as a function of the selected laser parameters : Remarques - Notes Il est normal que certains objets disparaissent par rapport à l'image de 2D, car la tranche en Z est plus fine - It is normal that some objects disappear compared to the 2D image, because the Z-slice is thinner.

  • Page 46: Charger Une Configuration - Load A Configuration

    Charger une configuration - Load a configuration Dans Acquisition Mode, cliquez sur le bouton Seq - In Acquisition Mode, click on the Seq button Un nouvel onglet apparaît : Sequential Scan - A new tab appears: Sequential Scan Cliquez sur le bouton Load - Click on the "Load"...