Table des Matières
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3 - Le plan expérimental
Les caractéristiques énumérées dans le chapitre précédent sont destinées à faciliter l'élaboration d'un plan
expérimental.
3-1 Choix de l'objectif :
compatible avec le questionnement ?
Si on travaille sur des objets épais, il faut faire également attention à la distance minimale de travail.
Note - Il peut être intéressant d'utiliser l'objectif 20x qui offre une distance de travail supérieure à 0,20mm
et surtout qui peut être utiliser avec une immersion glycérol – Ce milieu d'immersion a un indice de
réfraction de 1,466 (ou de 1,45 en mélange 80/20) qui est plus proche de celui de milieux de montages
comme le Mowiol ou le Vectashield, avec pour conséquence moins de déformation spatiale, chromatique et
sphérique (voir A5 – Milieu de montage vs milieu d'immersion - p.42)
3-2 Choix des fluorochromes
Il faut bien faire attention aux raies d'excitation disponibles (405, 458, 476, 488, 496, 514, 561 et 633nm) car
elles vont conditionner les choix des fluorochromes. On peut considérer que pour la plupart des
fluorochromes organiques le rendement de fluorescence chute trop fortement si on s'écarte de plus de 30nm
- en plus ou en moins - par rapport au maximum d'excitabilité.
Dans la mesure du possible il faut choisir les fluorochromes en fonction de leur longueur d'onde d'excitation
mise en rapport avec les structures qu'on souhaite observer. La résolution est environ 1,4 fois moins bonne
entre un fluorochrome excitable à 458nm et un fluorochrome excitable à 633nm. Ainsi il faut essayer de
réserver le fluorochrome excitable à la plus courte longueur d'onde pour les détails les plus fins.
3-3 Choix du support de préparation
La lamelle en verre, le milieu de montage et, si nécessaire, le milieu d'immersion font partie intégrante du
système optique. A l'exception du 10x tous les objectifs du système nécessitent une lamelle en verre
de 0,17mm entre l'objet et l'objectif. De même, à l 'exception du 10x et du 40x/0,75 tous doivent être
utilisés avec un liquide d'immersion. Les plastiques (fond de boite de pétri, plaques et lames à puits, etc)
n'ont pas les propriétés optiques permettant de faire une imagerie confocale correcte. Qui plus est, les lames
plastiques se déforment lorsqu'elles sont illuminées (déformations continues et aléatoires) ce qui rend
difficile toute acquisition confocale sur ces supports.
La sur-platine du microscope peut être équipée de supports spécifiques pour les boites de pétri (à fond de
lamelle de verre), pour les chambres de cultures et pour les plaques à puits (à fond de lamelle de verre).
Pour l'installation de ces supports, faire appel au responsable du microscope.
Il faut faire particulièrement attention à la résolution maximale ; est-elle
Par ailleurs les objectifs à immersion glycérol montrent une
meilleure capacité à imager en profondeur. Ainsi les deux
courbes ci-contre ont été obtenues en scannant un solution
10µM de fluorescéine dans un mélange glycérol 80/20. On voit
clairement la bien meilleure pénétration en profondeur de la
configuration
configuration huile (1,32 oil).
glycérol
(1,3
7
Les deux images ci-contre montrent
des
fibres
musculaires
montées dans du glycérol 80/20 et
imagées
sur
environ
d'épaisseur.
A gauche avec un objectif PL APO
63x1.32 immersion à huile et à
droite avec un objectif PL APO
63x1.32 immersion glycérol. On voit
clairement la forte déformation en
profondeur de l'objectif à immersion
à huile causée par la différence
d'indice entre le milieu de montage
(RI ~1,45) et le milieu d'immersion
(RI ~1,52).
GlyCorr)
par
rapport
GFP
100µm
à
la
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