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8-4 Imagerie spectrale
Le système de détection du SP5 est composé d'un prisme qui disperse la lumière d'émission laquelle est
ensuite dirigée sur une (ou plusieurs) fenêtre dont la largeur est ajustée par motorisation. C'est ce qui
permet de définir le domaine "spectrale" d'émission imagé dans les techniques précédentes.
Mais cette motorisation permet également de réaliser un balayage de fente, c'est à dire d'analyser la lumière
d'émission au travers d'une fenêtre spectrale "glissante" du bleu vers le rouge. La largeur de bande minimale
de cette fenêtre est de 5nm avec un pas de décalage (vers le rouge) de 3nm minimum. Il est ainsi possible
d'obtenir un spectre d'émission pour chaque voxel.
Les applications sont multiples :
analyse spectrale
–
caractérisation d'un signal d'auto-fluorescence
–
soustraction d'un signal d'auto fluorescence
–
séparation spectrale de fluorescences très rapprochées
–
imagerie hyper-spectrale
–
Les modes xyλ – xzλ – xyλz – xyλt – xzλt – xyzλt sont utilisables.
8-4-1 Obtention d'une image spectrale
- Sélectionner le mode xyλ.
- Dans la fenêtre "λ-Scan Range Properties" qui s'est ouverte, choisir d'abord un détecteur.
- Puis fixer les limites inférieure et supérieure du domaine
spectral qui sera analysé. Le système renvoie cette valeur dans
"Total Detection Range".
- Définir ensuite la largeur spectrale de la fenêtre "glissante" dans
la fenêtre "Detection Band Width".
Note - Attention ! Plus cette largeur est faible moins le
détecteur reçoit de photons. Il est donc conseillé de ne pas
descendre en dessous d'une valeur de 10nm.
Il est également conseillé d'ouvrir le pinhole de manière à
recueillir plus de lumière.
- Définir ensuite un pas d'échantillonnage dans la case "λ-
Detection Stepsize". Ici le critère de Nyquist ne s'applique pas et
on peut donc se contenter d'un léger recouvrement avec un pas inférieur de 2nm par rapport à la taille de la
fenêtre.
- En cliquant dans la fenêtre "No. of Detection Steps" le système renvoie le nombre de pas et corrige
éventuellement la valeur de ce pas pour s'ajuster à la largeur totale du domaine spectral à analyser.
- Choisir une fenêtre proche du maximum supposé du spectre d'émission du fluorochrome et comme pour
une acquisition standard régler puissance laser et gain en mode "Live".
Note - Attention ! Le signal ne
doit jamais être saturé dans aucune
fenêtre.
- Lancer l'acquisition en cliquant sur
"Start".
Une série d'images de toutes les
fenêtres spectrales, est enregistrée.
8-4-2 Obtention d'un spectre
d'émission
Pour analyser les spectres présents
dans cette image, aller dans l'onglet
"Process" (barre de menu en haut à
gauche), puis dans "Dye separation", puis "Spectral".
Chercher avec la crosshair une région présentant un spectre bien caractéristique (un seul pic bien marqué).
Note - si la crosshair n'est pas visible dans l'image, elle peut être activée en cliquant sur le
bouton dans la barre outils de l'image.
On peut élargir la région pour laquelle le spectre va être affiché soit en en indiquant une taille en voxels
dans la fenêtre "Measurement Area", soit en dessinant une ROI.
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