Microscopie En Fond Noir; Principes De La Microscopie À Immersion Dans L'huile - Optika Italy B-510 Série Manuel D'utilisation

11. Microscopie en fond noir

Le B-510DK est un système à fond noir spécifique pour l'analyse sanguine avec un condenseur spécial à fond
noir de 1,36 à 1,25 N.A. et un objectif plan-achromatique 100X à diaphragme iris réglable.
L'éclairage X-LED assure le haut niveau d'intensité lumineuse généralement nécessaire dans les techniques de
fond noir à fort grossissement.
Pour utiliser correctement ce microscope, il faut se familiariser avec :
a. technique d'immersion dans l'huile
b. la technique du fond noir.
Dans le manuel suivant, nous présentons les bases de ces méthodes (chapitres 11.1 et 11.2), puis nous don-
nons un guide étape par étape de la configuration du B-510DK (chapitre 11.3).
Des conseils généraux pour la microscopie par immersion sont également donnés.
11.1 Principes de la microscopie à immersion dans l'huile
La capacité d'un objectif de microscope à capturer les rayons
lumineux déviés d'un échantillon dépend à la fois de l'ouver-
ture numérique et du milieu dans lequel la lumière voyage.
L'ouverture numérique d'un objectif est directement propor-
tionnelle à l'indice de réfraction du milieu d'imagerie entre la
lamelle de protection et la lentille frontale, ainsi qu'au péché
de la moitié de l'ouverture angulaire de l'objectif.
Comme le péché ne peut être supérieur à 90 degrés, l'ouver-
ture numérique maximale possible est déterminée par l'indi-
ce de réfraction du milieu d'immersion.
La plupart des objectifs de microscope utilisent l'air comme
milieu à travers lequel les rayons lumineux doivent passer
entre la lamelle protégeant l'échantillon et la lentille avant de
l'objectif. Les objectifs de ce type sont appelés objectifs secs
parce qu'ils sont utilisés sans milieu d'imagerie liquide.
L'air a un indice de réfraction de 1.0003, très proche de celui
du vide et considérablement inférieur à celui de la plupart
des liquides, y compris l'eau (n = 1.33), la glycérine (n =
1.470) et les huiles à immersion courantes pour microscope
(moyenne n = 1.515).
En pratique, l'ouverture numérique maximale d'un système
d'objectif sec est limitée à 0.95, et des valeurs supérieu-
res ne peuvent être obtenues qu'en utilisant des optiques
conçues pour des milieux d'immersion.
Le principe de l'immersion dans l'huile est démontré à la Fig.
20, où des rayons lumineux individuels sont tracés à travers l'échantillon et passent dans l'objectif ou sont
réfractés dans d'autres directions. La Fig. 20(a) illustre le cas d'un objectif sec avec cinq rayons (étiquetés de 1 à
5) passant à travers un échantillon recouvert d'une lamelle. Ces rayons sont réfractés à l'interface coverlip-air et
seuls les deux rayons les plus proches de l'axe optique (rayons 1 et 2) du microscope ont l'angle approprié pour
pénétrer dans la lentille frontale de l'objectif. Le troisième rayon est réfracté à un angle d'environ 30 degrés par
rapport à la lamelle et n'entre pas dans l'objectif. Les deux derniers rayons (4 et 5) sont réfléchis à l'intérieur de
la lamelle et, avec le troisième rayon, contribuent à la réflexion interne de la lumière sur les surfaces vitrées qui
ont tendance à dégrader la résolution des images. Lorsque l'air est remplacé par de l'huile ayant le même indice
de réfraction que le verre, comme le montre la Fig. 20(b), les rayons lumineux passent maintenant directement
à travers l'interface verre-huile sans déviation due à la réfraction. L'ouverture numérique est ainsi augmentée du
facteur n, l'indice de réfraction de l'huile.
Immersion dans l'huile et
Ouverture Numérique
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Fig. 20