Principios De Iluminación De Campo Oscuro - Optika Italy B-510 Série Manuel D'utilisation

11.2 Principios de iluminación de campo oscuro
La microscopía de campo oscuro es una técnica de
iluminación especializada que aprovecha la iluminación
oblicua para mejorar el contraste en muestras que no
son bien visualizadas bajo condiciones normales de
iluminación de campo claro.
Todos nosotros estamos bastante familiarizados con la
apariencia y la visibilidad de las estrellas en una noche
oscura, a pesar de su enorme distancia de la tierra. Las
estrellas se pueden ver debido al marcado contraste
entre su tenue luz y el cielo negro.
Este principio se aplica en la microscopía de campo
oscuro (también llamada de fondo oscuro), un método
simple y popular para hacer que los objetos no
manchados sean claramente visibles. Estos objetos
suelen tener índices de refracción muy cercanos a los de
su entorno y son difíciles de visualizar en la microscopía
de campo claro convencional. Por ejemplo, muchos
organismos acuáticos pequeños tienen un índice de
refracción que oscila entre 1,2 y 1,4, lo que resulta en
una diferencia óptica insignificante con respecto al medio
acuoso circundante. Estos son candidatos ideales para
la iluminación de campo oscuro.
La iluminación de campo oscuro requiere bloquear la
luz central que normalmente pasa a través y alrededor
del espécimen, permitiendo que sólo los rayos oblicuos
de cada acimut "golpeen" el espécimen montado en
el portaobjetos del microscopio. La lente superior de
un simple condensador de campo oscuro de Abbe es
esféricamente cóncava, permitiendo que los rayos de luz
que emergen de la superficie en todos los acimutes formen
un cono hueco invertido de luz con un ápice centrado en
el plano de la muestra. Si no hay ningún espécimen presente y la apertura numérica del condensador es mayor
que la del objetivo, los rayos oblicuos se cruzan y todos estos rayos no podrán entrar en el objetivo debido a
su oblicuidad. El campo de visión aparecerá oscuro.
El par condensador de campo oscuro/objetivo ilustrado en la Fig. 22 es una disposición de apertura numérica
alta que representa la microscopía de campo oscuro en su configuración más sofisticada, que se discutirá
en detalle más adelante. El objetivo contiene un diafragma interno de iris que sirve para reducir la apertura
numérica del objetivo a un valor inferior al del cono de luz hueco invertido emitido por el condensador. El
condensador cardioide es un diseño de campo oscuro reflectante que se basa en espejos internos para
proyectar un cono de luz libre de aberraciones sobre el plano de la muestra.
Cuando se coloca un espécimen en el portaobjetos, especialmente un espécimen no manchado y no
absorbente de luz, los rayos oblicuos atraviesan el espécimen y son difractados, reflejados y/o refractados por
discontinuidades ópticas (tales como la membrana celular, el núcleo y los orgánulos internos) que permiten
que estos rayos tenues entren en el objetivo. El espécimen puede entonces verse brillante sobre un fondo
que de otro modo sería negro. En términos de óptica de Fourier, la iluminación de campo oscuro elimina el
orden de cero (luz no dispersa) del patrón de difracción formado en el plano focal trasero del objetivo. Esto da
como resultado una imagen formada exclusivamente a partir de intensidades de difracción de orden superior
dispersas por el espécimen.
Los candidatos ideales para la iluminación de campo oscuro incluyen organismos acuáticos vivos diminutos,
diatomeas, insectos pequeños, huesos, fibras, cabello, bacterias no manchadas, levaduras y protozoos.
Los especímenes no biológicos incluyen cristales minerales y químicos, partículas coloidales, especímenes
de conteo de polvo y secciones delgadas de polímeros y cerámicas que contienen pequeñas inclusiones,
diferencias de porosidad o gradientes de índice de refracción.
Objetivo
de alta
apertura
numérica
Cono de luz
oblicua
Espejo
cóncavo
Luz de la
fuente
Condensador cardioide para
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Luz a los
oculares
Diafragma Iris
Specimen
Slide
Condensador
cardioide
Parada de
luz opaca
campo oscuro
Espejo
Convexo
Fig. 22