Microscopia In Campo Scuro; Principi Di Microscopia Con Immersione In Olio - Optika Italy B-510 Série Manuel D'utilisation

11. Microscopia in campo scuro

Il B-510DK è un microscopio per osservazione in campo scuro specifico per l'analisi del sangue con uno speciale
condensatore per campo scuro extra efficiente, con A.N. da 1.36 a 1.25 e un obiettivo plan acromatico da 100x
con diaframma regolabile.
L'illuminazione a LED X garantisce l'alto livello di intensità della luce tipicamente necessario nelle tecniche
campo scuro ad alto ingrandimento.
Per utilizzare correttamente questo microscopio, è necessario acquisire familiarità con:
a. la tecnica di immersione in olio
b. la tecnica di campo scuro.
Nel seguente manuale vengono introdotte le basi di questi metodi (paragrafi 11.1 e 11.2) ed anche una guida
passo-passo alla configurazione del B-510DK (paragrafo 11.3).
Vengono forniti anche consigli generali per la microscopia a immersione.
11.1

Principi di microscopia con immersione in olio

La capacità dell'obiettivo del microscopio di catturare i raggi
di luce deviati da un campione dipende sia dall'apertura
numerica sia dal mezzo attraverso cui la luce viaggia.
L'apertura numerica di un obiettivo è direttamente
proporzionale all'indice di rifrazione del mezzo tra il
coprioggetto e la lente frontale, e anche al seno di metà
dell'apertura angolare dell'obiettivo.
Poiché il seno non può essere maggiore di 90 gradi, l'apertura
numerica massima possibile è determinata dall'indice di
rifrazione del mezzo di immersione.
La maggior parte degli obiettivi di un microscopio utilizza
l'aria come mezzo attraverso il quale i raggi di luce devono
passare tra il coprioggetto che protegge il campione e
la lente frontale dell'obiettivo. Gli obiettivi di questo tipo
vengono definiti obiettivi a secco perché vengono utilizzati
senza mezzi intermedi liquidi.
L'aria ha un indice di rifrazione di 1.0003, molto vicino a
quello del vuoto e considerevolmente inferiore alla maggior
parte dei liquidi, tra cui acqua (n = 1.33), glicerina (n =
1.470) e comuni oli da immersione al microscopio (media
n = 1.515).
In pratica, l'apertura numerica massima di un sistema di
obiettivi a secco è limitata a 0,95 e valori maggiori possono
essere raggiunti solo utilizzando l'ottica progettata per il
mezzo di immersione.
Il principio dell'immersione in olio è dimostrato in Fig. 20 dove i singoli raggi di luce sono tracciati attraverso
il campione e passano nell'obiettivo o sono rifratti in altre direzioni. La Fig. 20(a) illustra il caso di un obiettivo
secco con cinque raggi (etichettati da 1 a 5) mostrati passando attraverso un campione coperto con un vetrino
coprioggetto. Questi raggi sono rifratti nell'interfaccia vetrino-aria e solo i due raggi più vicini all'asse ottico del
microscopio (raggi 1 e 2) hanno l'angolo appropriato per entrare nella lente frontale obiettivo. Il terzo raggio
viene rifratto con un angolo di circa 30 gradi rispetto al coprioggetto e non entra nell'obiettivo. Gli ultimi due raggi
(4 e 5) sono riflessi internamente indietro attraverso il coprioggetto e, insieme al terzo raggio, contribuiscono a
riflessi interni di luce su superfici di vetro che tendono a degradare la risoluzione dell'immagine.
Quando l'aria viene sostituita dall'olio con lo stesso indice di rifrazione del vetro, mostrato nella Fig. 20(b), i
raggi luminosi passano direttamente attraverso l'interfaccia vetro-olio senza deviazione dovuta alla rifrazione.
L'apertura numerica è quindi aumentata dal fattore di n, l'indice di rifrazione dell'olio.
Immersione in olio e
Apertura Numerica
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Fig. 20