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8.2.2
Traitement par uracil-N-Glycosylase (UNG)
Le PelvoCheck
CT/NG PCR MasterMix contient du dUTP, qui est intégré dans les produits
®
d'amplification pendant la PCR PelvoCheck
dégradés par l'UNG. L'UNG coupe le produit de PCR au niveau des sites où un résidu de déoxyuridylate
a été incorporé. Les produits de PCR coupés ne seront pas amplifiés dans la réaction suivante. Un
traitement UNG peut donc aussi être utilisé pour éliminer une contamination par recirculation liée aux
réactions PCR précédentes
!
Le système UNG intégré dans la PCR PelvoCheck
produits de PCR des PCR précédentes. Il est impossible d'éliminer les autres contaminations, survenant
par exemple pendant la préparation de l'échantillon, l'extraction d'ADN ou l'ajout de modèle à la réaction
PCR. Il est donc toujours nécessaire de suivre les instructions et les précautions particulières pour éviter la
contamination décrite au chapitre 7.
L'uracil-N-glycosylase ne fait pas partie du kit PelvoCheck
auprès de Fermentas (voir les informations utiles pour la commande au chapitre 2).
Diluer l'uracil-N-glycosylase à 1/50 dans de l'eau de qualité PCR (la concentration finale est
¯
de 0,02 U/µL). Utiliser une nouvelle dilution d'UNG pour chaque préparation de réaction PCR
PelvoCheck
CT/NG (voir le chapitre 8.2.3). Ne pas réutiliser l'UNG dilué.
®
Mélanger soigneusement la dilution d'UNG en la passant au vortex pendant 2 secondes puis en
¯
la centrifugeant, ou en la pipetant plusieurs fois.
!
Le kit de test PelvoCheck® CT/NG a été validé avec l'uracil-N-glycosylase de Fermentas (voir le chapitre 2).
Il est impératif d'utiliser cette enzyme pour atteindre les performances établies.
Ajouter 1 µL de cette dilution à chaque réaction PCR PelvoCheck
¯
Tableau 2).
!
Cette quantité est suffisante pour éliminer la contamination par recirculation de la PCR. Veiller à ne pas
utiliser une solution d'UNG plus concentrée car cela pourrait nuire aux performances de la PCR, avec pour
résultat une baisse de la sensibilité de PelvoCheck
En général, pour le traitement de l'UNG, le mélange réactionnel de PCR est incubé pendant
20 minutes à 37 °C. L'UNG est par la suite inactivé par une étape d'incubation supplémentaire de
15 minutes à 95 °C. Ces deux étapes sont déjà intégrées dans le PCR PelvoCheck
et correspondants aux deux premières étapes du programme du thermocycleur (voir le Tableau 1,
en page 24). L'inactivation de l'uracil-N-glycosylase et l'activation de la HotStarTaq
produisent au cours de la seconde étape (15 minutes à 95 °C).
L'achat du PelvoCheck® CT/NG s'accompagne d'une licence limitée en vertu des brevets américains n° 5 035 996,
18
5 683 896, 5 945 313, 6 287 823 et 6 518 026, ainsi que des brevets étrangers correspondants.
Longo, M.C., et al. (1990) Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain
19
reactions, Gene, 93, 125-128.
PelvoCheck
CT/NG - Mode d'emploi
®
Révision : BQ-029-03 / Décembre 2014
CT/NG ; les produits de PCR risquent donc d'être
®
.
19
®
18
CT/NG n'élimine que la contamination croisée avec les
CT/NG et doit être achetée séparément
®
CT/NG (voir le chapitre 8.2.3,
®
CT/NG.
®
CT/NG PCR
®
polymérase se
®
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