Techniques De Mesure; Intensité De Fluorescence (Fi); Transfert D'énergie De Fluorescence Par Résonance (Fret) - tecan Infinite 200 PRO Serie Notice D'utilisation

2.4

Techniques de mesure

2.4.1 Fluorescence
A) Intensité de fluorescence (FI)
B) Transfert d'énergie de fluorescence par résonance (FRET)
2021-06 Notice d'utilisation pour Infinite 200 PRO n° 30160738
Les sections suivantes présentent les techniques de mesure du lecteur Infinite
lorsqu'il est entièrement équipé. Pour synthétiser cette présentation, quelques
simplifications ont été apportées. Consulter les références pour plus de détails.
Le lecteur Infinite offre la possibilité d'appliquer la technique de mesure de
fluorescence de base et certaines variantes bien plus exigeantes :
•
Intensité de fluorescence (FI) (ou pour simplifier : Fluorescence)
•
Transfert d'énergie de fluorescence par résonance (FRET)
•
Fluorescence résolue en temps (TRF)
•
Polarisation de fluorescence (FP – Infinite F Plex uniquement)
La FI peut également être utilisée pour mesurer le Transfert d'énergie de
fluorescence par résonance (FRET). Pour certaines applications de
microplaques, le FRET offre des avantages par rapport à la FI et à la TRF, car il
simplifie la préparation de l'essai. Il s'applique de préférence pour les études de
liaison de mélange et de mesure. Par rapport à la FP, le FRET nécessite le
marquage approprié des deux partenaires de liaison. D'autre part, le FRET peut
utiliser des marqueurs de TRF pour une sensibilité accrue, puis être référencé
comme HTRF (TRF homogène).
La TRF ne doit pas être confondue avec les mesures de la durée de vie de
fluorescence.
Des molécules fluorescentes émettent une lumière d'une longueur d'onde
spécifique lorsqu'elles sont heurtées par de la lumière d'une longueur d'onde plus
courte (déplacement de Stokes). En particulier, une seule molécule fluorescente
peut apporter un photon de fluorescence (quantum de lumière). Ceci fait partie de
l'énergie qui a été absorbée auparavant (excitation électronique), mais elle ne
peut pas être libérée suffisamment rapidement en énergie thermique.
Le délai moyen entre excitation et émission est appelé la durée de vie de
fluorescence. Pour de nombreuses espèces moléculaires fluorescentes, la durée
de vie de fluorescence est de l'ordre de quelques nanosecondes (fluorescence
immédiate). Après l'excitation, une émission de fluorescence se produit avec une
certaine probabilité (rendement quantique), qui dépend des espèces
fluorescentes et des conditions environnementales.
Pour un traité détaillé des techniques et des applications de fluorescence :
Principles of Fluorescence Spectroscopy de Joseph R. Lakowicz, Plenum
Press.
Dans de nombreuses applications de microplaques, l'intensité d'émission de
fluorescence est mesurée pour déterminer l'abondance de composés
fluorescents marqués. Dans ces essais, d'autres facteurs ayant une influence sur
l'émission de fluorescence doivent être contrôlés à titre expérimental. La
température, la valeur du pH, l'oxygène dissous, le type de solvant, etc. peuvent
affecter considérablement le rendement quantique de fluorescence et par
conséquent, les résultats de mesure.
Dans certaines applications de microplaques, une stratégie évoluée de double
marquage est utilisée. L'effet de FRET vous permet de mesurer la quantité des
deux composés marqués différemment se trouvant à proximité immédiate. Il
convient ainsi parfaitement pour les études de liaison.
2. Description générale
version 1.4 19