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Correction de la mise en phase empirique
Lors de la réaction de séquençage, chaque brin d'ADN dans un amplifiat s'étend d'une
base par cycle. La mise en phase et la mise en préphase ont lieu lorsqu'un brin est déphasé
par rapport au cycle d'incorporation en cours.
}
La mise en phase se produit lorsqu'un brin a un retard d'une base.
}
La mise en préphase se produit lorsqu'un brin a une avance d'une base.
Figure 14
A
Lecture avec une base présentant une mise en phase
Lecture avec une base présentant une mise en préphase
B
RTA2 corrige les effets de la mise en phase et de la mise en préphase à l'aide de
l'algorithme de correction empirique de la mise en phase, qui optimise la qualité des
données à chaque cycle tout au long de l'analyse.
Définition des bases
Après la correction des intensités brutes en termes d'interférence, de mise en phase et de
mise en préphase, le canal de couleur dont l'intensité est la plus forte correspond à la
définition des bases pour cet amplifiat dans ce cycle. La définition des bases sur le système
HiSeq 3000 à l'aide de RTA2 commence après le cycle 3.
La définition des bases détermine une base (A, C, G ou T) pour chaque amplifiat d'une
plaque donnée d'un cycle spécifique. Les définitions des bases sont enregistrées dans des
fichiers de définition des bases (*.bcl). Il s'agit de fichiers binaires comportant un octet par
définition et par score de qualité. Chaque fichier de définition des bases contient la
définition des bases et le score de qualité qui lui est associé. Pour qu'une base puisse être
définie pour un amplifiat, celui-ci doit d'abord franchir le filtre de pureté. Les amplifiats
qui ne passent pas le filtre ou qui ne peuvent pas être définis car ils sont en dehors de
l'image ou parce que l'enregistrement de l'image a échoué sont des « no-calls » (sans
définition). On représente un « no-call » par la mention « (N) ».
Amplifiats passant le filtre
Pendant les 25 premiers cycles de la lecture 1, le filtre de pureté supprime les amplifiats de
mauvaise qualité des résultats d'analyse. Les amplifiats passent le filtre s'il n'existe pas
plus d'une définition des bases présentant une valeur de pureté inférieure à 0,6 dans les
25 premiers cycles. La pureté est définie comme le rapport de l'intensité de base la plus
brillante divisée par la somme de l'intensité de base la plus brillante et de la deuxième
plus brillante. Dans les rapports d'analyse, on représente le pourcentage d'amplifiats
passant le filtre par la mention « %PF ».
Guide du système HiSeq 3000
Mise en phase et en préphase
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