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10.
Établissement d'un environnement sans ribonucléases
Les ribonucléases sont extrêmement difficiles à inactiver. Prenez garde de ne pas introduire de RNases dans vos échantillons d'ARN
pendant et après leur purification. Ceci est particulièrement important si le matériel de départ est difficile à obtenir ou s'il ne peut pas
être remplacé. Les conseils ci-dessous peuvent aider à éviter la contamination accidentelle de vos échantillons par les RNases.
1.
Deux des sources les plus courantes de contamination par RNases sont les mains de l'utilisateur et les bactéries ou moisissures
pouvant être présentes dans les poussières de l'air. Pour éviter la contamination provenant de ces sources, utilisez une
technique stérile lors de la manipulation des réactifs fournis dans ce système. Portez des gants à tout moment. Changez de
gants chaque fois qu'un contact avec des RNases peut s'être produit.
2.
Autant que possible, utilisez des récipients ou fournitures en plastique stériles et jetables pour la manipulation de l'ARN.
Ces fournitures ne sont généralement pas contaminées par les RNases et aucun traitement d'inactivation de ces enzymes
n'est nécessaire.
3.
Traitez les récipients ou fournitures en verre ou en plastique non stériles et les cuves d'électrophorèse avant de les utiliser pour
s'assurer qu'elles ne contiennent pas de RNases. Incubez les récipients ou fournitures en verre dans des fours à 200 °C pendant
toute la nuit. Rincez les récipients ou fournitures en plastique avec une solution de NaOH à 0,1 N et d'EDTA à 1 mM, puis à l'eau
sans RNases. Les produits destinés à l'élimination des RNases peuvent également être utilisés selon les instructions du fabricant.
Remarque : les cuves d'électrophorèse peuvent être contaminées par des ribonucléases, la RNase A en particulier, suite à
l'analyse d'échantillons d'ADN. Dans la mesure du possible, réservez exclusivement à l'analyse de l'ARN une nouvelle cuve
d'électrophorèse ou une cuve décontaminée.
4.
Traitez les solutions non fournies dans le système en ajoutant du diéthyl dicarbonate (DEPC) à 0,1 % (v/v) sous une hotte de
laboratoire. Incubez à température ambiante sous agitation pendant toute la nuit sous la hotte. Stérilisez en autoclave pendant
30 minutes pour éliminer les traces de DEPC.
Attention : le DEPC est un cancérigène présumé et ne doit être utilisé que sous une hotte de laboratoire. Le DEPC réagit
rapidement avec les amines et, de ce fait, ne peut pas être utilisé pour les solutions tamponnées au Tris.
Remarque : il est essentiel de continuer à protéger vos échantillons d'ARN contre les RNases dans toutes les procédures
ultérieures. Portez des gants propres et utilisez des solutions et tubes à centrifugation sans RNases.
5295MA.eps
11.
Références
1.
Clinical Laboratory Standards Institute (2007) Handling, transport, and storage of specimens for molecular methods.
Ce document peut être consulté en ligne au site : www.clsi.org
2.
Murray, P.R. et al. (2007) Manual of Clinical Microbiology, 9th Edition, ASM Press.
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