Table des Matières
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Annexe B
conçues à l'aide du logiciel PyroMark ADSW, l'amorce à
biotinyler est indiquée.
Il convient de purifier l'amorce biotinylée par HPLC ou un
procédé équivalent dans la mesure où la biotine libre entre
en concurrence avec le produit de PCR biotinylé pour se lier
aux billes de Sepharose recouvertes de streptavidine.
Longueur de l'amplicon
La longueur optimale de l'amplicon pour le pyroséquençage
est de 80 à 200 pb, bien que des produits contenant jusqu'à
500 pb peuvent également convenir. Idéalement, les
amplicons destinés aux analyses CpG doivent comporter
moins de 200 pb.
Amorce de séquençage
Concevoir les amorces de séquençage à l'aide du logiciel
PyroMark ADSW. Lors de la mise au point d'une analyse des
InDels, il est fortement recommandé que l'amorce de
séquençage se trouve quelques paires de bases avant la
position variable. Il est recommandé d'utiliser les tests
QIAGEN de diagnostic in vitro pour pyroséquençage qui
contiennent toutes les amorces optimisées nécessaires.
Configuration de la PCR
Les mélanges réactionnels de PCR de 25 µl sont préparés à
l'aide du kit PyroMark PCR. Veiller à suivre les instructions du
manuel fourni avec le kit.
Réaliser 45 cycles de PCR à la température d'hybridation
optimale. La réduction du nombre de cycles peut fournir un
rendement insuffisant et entraîner des problèmes de bruit de
fond lors des réactions de pyroséquençage en raison d'un
excès d'amorce biotinylée non utilisée.
Analysé sur gel d'agarose, le produit de PCR doit donner
une seule bande de forte intensité avec un excès d'amorce
minimal.
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Manuel d'utilisation du PyroMark Q24 MDx 01/2016
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