Table des Matières
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Annexe B
Quantité de matrice de démarrage
L'efficacité de l'hybridation de l'amorce sur la matrice est un
facteur important pour la PCR. En raison de la nature
thermodynamique de la réaction, le rapport amorce/matrice
influence fortement la spécificité et l'efficacité de la PCR et
doit être optimisé de manière empirique. Si la quantité de
matrice utilisée est insuffisante, il se peut que les amorces ne
détectent pas leurs séquences complémentaires. Un excès de
matrice peut entraîner une augmentation du nombre de
problèmes d'amorçage.
Optimisation de la PCR
Le kit PyroMark PCR donne des résultats satisfaisants dans la
plupart des cas. Toutefois, si une concentration plus élevée
en Mg
à 25 mM fourni dans le kit.
Lors de l'utilisation du logiciel PyroMark ADSW 2.0, la
température d'hybridation recommandée est de 60 °C pour
l'ADN génomique et 56 °C pour l'ADN traité par le bisulfite.
L'ajout de Q-Solution
peut améliorer le rendement et la spécificité de la PCR dans
le cas de matrices difficiles qui, par exemple, présentent un
degré élevé de structure secondaire ou sont riches en paire
de bases GC.
Pour tous les essais d'optimisation de la PCR, analyser 5 µl
d'une solution de PCR de 25 µl sur gel d'agarose et viser
l'obtention d'une bande spécifique de forte intensité et d'un
excès minimal d'amorce.
Pour la résolution des problèmes, se reporter au PyroMark
PCR Handbook (Manuel du kit PyroMark PCR).
Amplification égale des deux allèles lors des
analyses AQ et CpG
La fiabilité des résultats d'analyse quantitative dépend de
l'égale amplification des deux allèles et ce critère doit être
soigneusement vérifié.
8-12
2+
est nécessaire, il est recommandé d'utiliser le MgCl
®
(fournie dans le kit PyroMark PCR)
Manuel d'utilisation du PyroMark Q24 MDx 01/2016
2
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