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ANNEXE
E
Préparation des échantillons/lames
102
2
Travaillez sous hotte de sécurité biologique et portez des vêtements, des
gants et un masque de protection. Transférez un maximum de 10 mL de
crachat, d'urine ou d'un autre fluide à traiter dans un tube de
centrifugation en plastique de 50 mL, conique, stérile, à usage unique,
muni d'un bouchon en plastique à visser, anti-fuite et sans aérosol.
Privilégierles tubes munis de marques indicatrices de volume facilement
lisibles.
3
Ajoutez un volume égal de mélange de digestion fraîchement préparé au
tube, en veillant à verser le mélange de digestionsans toucher le rebord du
récipient à pécimen, ce qui pourrait par inadvertance transférer du
matériel positif à un échantillon négatif. Vissez le bouchon à fond.
4
Passez l'échantillon au Vortex pendant 15 à 30 secondes maximum, en
s'assurant de créer un tourbillon dans le liquide et pas une simple
agitation. Vérifier l'homogénéité en inversant le tube. Si des agrégats
subsistent, passez le spécimen au vortex par intermittences pendant que
les autres spécimens sont en digestion. Une pincée supplémentaire de
cristaux NALC peut être nécessaire pour liquéfier des crachats muqueux.
5
Après avoir terminé le vortex du premier spécimen, réglez la minuterie sur
15 minutes. Continuer à digérer les autres spécimens, en notant le temps
mis pour tout le cycle. Les échantillons doivent rester au contact du
mélange de digestion pendant 20 minutes maximum.
6
Après 15 minutes de digestion, complétez avec du tampon phosphate pour
arriver à 1 cm de la partie supérieure du tube; vissez le bouchon
hermétiquement et agitez le tube pour mélanger les solutions et arrêter le
processus de digestion. L'addition de cette solution permet également de
réduire le poids spécifique de l'échantillon, ce qui facilite la sédimentation
des bacilles pendant la centrifugation.
7
Centrifugez tous les tubes à 3600X g pendant 15 minutes, à l'aide de
cupules de centrifugation scellées sans aérosols.
8
Versez délicatement le surnageant dans un récipient étanche aux
éclaboussures. Pour s'assurer que l'échantillon ne s'écoule pas sur
l'extérieur du tube après l'avoir versé, le rebord du tube peut être essuyé
avec de la gaze imbibée de phénol ou d'Amphyl pour absorber les gouttes.
Veillez à ce qu'aucun rebord de tube ne touche un autre récipient. Il est
utile de surveiller attentivement les sédiments pendant que l'éviction du
surnageant, car un sédiment très mucoïde peut être lâche et se déverser
avec le surnageant. Si les sédiments commencent à glisser, arrêtez de
verser et utilisez une pipette capillaire stérile pour éliminer le surnageant
sans perdre le sédiment.
9
Remettre en suspension le sédiment dans 1 à 2 mL de tampon phosphate à
pH 6,8.
10 Inoculez les sédiments sur un milieu de culture et préparez des lames.
11 Passez les sédiments concentrés au Vortex. Prélevez 0,1 à 0,2 mL à l'aide d'
une pipette Pasteur et ajoutez 2 à 3 gouttes sur la lame. A l'aide de
l'extrémité de la pipette, ou d'un bâton applicateur stérile, placés
parallèlement à la lame. Etalez lentement et uniformément le liquide pour
obtenir un frottis mince.
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