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Plateau technique
d'imagerie cellulaire
INFINITy-Purpan
Mars 2021
Mode d'emploi
Microscope Confocal Zeiss LSM 710
1
Plateau technique d'imagerie cellulaire INFINITy-Purpan
Sophie Allart -
sophie.allart@inserm.fr
- Simon Lachambre -
simon.lachambre@inserm.fr
Tél : 05. 62. 74. 45. 78
05. 31. 54. 79. 01
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Manuels Connexes pour Zeiss LSM 710
Sommaire des Matières pour Zeiss LSM 710
- Page 1 Plateau technique d'imagerie cellulaire INFINITy-Purpan Mars 2021 Mode d'emploi Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Plateau technique d’imagerie cellulaire INFINITy-Purpan Sophie Allart - sophie.allart@inserm.fr - Simon Lachambre - simon.lachambre@inserm.fr Tél : 05. 62. 74. 45. 78 05. 31. 54. 79. 01...
- Page 2 Détecteur Et 2 PMT spectraux (réseau et fente) Images multi-marquages en séquentiel 2D à 5D Acquisition 10 couleurs possibles Zeiss ZEN Reconstruction de volumes 3D, projections, Logiciel d’acquisition quantification, Plateau technique d’imagerie cellulaire INFINITy-Purpan Sophie Allart - sophie.allart@inserm.fr - Simon Lachambre - simon.lachambre@inserm.fr...
- Page 3 Système d’exploitation Windows VISTA PC 2Go RAM, 3.7 Ghz + graveur dvd Ordinateur Filtre 38: Excitation: BP 470/40 Beam Splitter: FT495 Emission: BP 525/50 Fluorochromes: 5-Carboxyfluorescein (5-FAM) 5-FAM (5-Carboxyfluorescein) Acridine Orange, both DNA & RNA Acridine Yellow Alexa Fluor 488™ Astrazon Orange R Auramine Aurophosphine Cy2™...
- Page 4 Excitation: BP 445/25 Beam Splitter: FT570 Emission: BP 605/70 Fluorochromes: DsRed (Red Fluorescent Protein) Ethidium Bromide Fluor Ruby Magdala Red (Phloxin B) Phloxin B (Magdala Red) Rhodamine B Rhodamine BB Rhodamine B 200 R-phycoerithrin (PE) Sevron Brilliant Red B Xylene Orange FilterSet 49 Excitation: G365 Beam Splitter: FT395...
- Page 5 methylcoumarin pH 7.0; 7-Hydroxy-4-methylcoumarin; 7-Hydroxy-4-methylcoumarin pH 9.0; Alexa 350; AMCA conjugate; Amino Coumarin; BFP (Blue Fluorescent Protein); Cascade Blue; Coumarin; DAPI; DAPI-DNA; DyLight 350; Hoechst 33258; Hoechst 33258- DNA; Hoechst 33342; Indo-1 Ca2+; Indo-1, Ca free; Indo-1, Ca saturated; LysoSensor Blue; LysoSensor ;...
- Page 6 ON dans l'onglet Laser. N.B: Pour l'analyse d'image, il existe une version offline de Zen gratuite pour les PC à télécharger sur le site de Zeiss. Plateau technique d’imagerie cellulaire INFINITy-Purpan Sophie Allart - sophie.allart@inserm.fr...
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Page 7: Observation Des Échantillons Aux Oculaires
Observation des échantillons aux oculaires Allez dans Occular (1) et cliquez sur Offline(2). Choisissez l'objectif (5) et en fonction du marquage à observer le cube (6). Allumez la lampe fluo (7) ou la lumière blanche (3) pour faire de la transmission. Vous pouvez aussi piloter le microscope à... -
Page 8: Charger Une Configuration
Charger une configuration Ouvrir dans Configuration et choisir la configuration qui vous convient selon vos marquages. Le microscope va automatiquement sélectionner pour chaque marquage l'excitation et l'émission. Il n'y a rien à modifier dans les onglets Lasers, Imaging Setup et Light Path. Plateau technique d’imagerie cellulaire INFINITy-Purpan Sophie Allart - sophie.allart@inserm.fr... -
Page 9: Régler Les Paramètres Pour L'acquisition
Régler les paramètres pour l'acquisition Allez dans Acquisition Mode. Taille de l'image: Choisissez la taille de votre image (classiquement on fait du 512 x 512 pixels). En cliquant sur le bouton Optimal, on obtient la dimension en pixels idéale de l'image. Il ne sert à... - Page 10 pixels bleus et noirs dans le fond. De manière générale, une valeur de 0 ou -1 est optimale. Faire la même chose pour tous les autres canaux. Quand deux canaux utilisent le PMT spectral (ChS), ils ont le même gain. Il faudra alors le régler sur le gain le plus faible et ensuite jouer sur le laser pour obtenir une bonne image.
- Page 11 Cliquez sur Snap pour acquérir une seule image Acquérir une image en transmission Pour acquérir en transmission, sélectionnez une configuration avec Trans. On peut voir dans Light Path que le PMT de la transmission est coché (T-PMT). Plateau technique d’imagerie cellulaire INFINITy-Purpan Sophie Allart - sophie.allart@inserm.fr - Simon Lachambre -...
- Page 12 Dans Channels, réglez le gain du PMT de la transmission. La transmission est acquise simultanément avec un canal fluo: la source d'excitation (le laser) est donc commune et sa valeur est la même pour le canal fluo et pour le canal de la transmission. Il faut donc jouer sur le gain pour obtenir une bonne image.
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Page 13: Echantillonnage Spatial
Dans Scan Area, vous pouvez voir et changer vos paramètres de zoom. Echantillonnage spatial 0.4 - La résolution dépend de l’objectif : r= Plateau technique d’imagerie cellulaire INFINITy-Purpan Sophie Allart - sophie.allart@inserm.fr - Simon Lachambre - simon.lachambre@inserm.fr Tél : 05. 62. 74. 45. 78 05. - Page 14 - La taille du pixel est ajustable. Selon le théorème de Nyquist, l’échantillonnage idéal doit être de : Objectif r (à 543 nm) 271.5 nm 155 nm 118 nm 67.5 nm Echantillonnage idéal Taille du pixel (512x512) 830nm 260 nm Zoom =1 280 nm 90 nm...
- Page 15 Faire une pile d'images Cochez Zstack. Dans le menu Multi Dimensional Acquisition la pile d'image peut s'acquérir de deux façons: le mode First/Last permet de fixer les limites de la pile alors qu'avec le mode Center, c'est le centre de la pile qui est fixé. - First/Last: Cliquer sur Live ou Continuous, déplacez-vous en Z à...
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Page 16: Extinction Du Système
Toute image acquise sur le LSM 710 doit être sauvegardée en format .lsm afin de conserver les méta données. Vous pouvez ensuite sauvegarder en .tif mais PAS en Jpeg (qui compresse donc perd des informations). Les images 2D non sauvegardées sont automatiquement écrasées par le programme au scanning suivant (mais pas les images 3D). - Page 17 Rappels Nettoyer les objectifs à immersion utilisés avec un Kimwipes et de l'alcool à la fin de la séance. Ne pas réserver une session de plus de deux heures pour des échantillons fixés et quatre heures pour des échantillons vivants. Récupérer le plus rapidement possible les données après acquisitions (nettoyage mensuel de l'ordinateur).