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Méthodes UV
Impureté protéiques
La présence d'acide nucléique dans une solution de protéine peut avoir un effet
important étant donné la forte absorbance de nucléotides à 280 nm. Pour compenser
cet effet en mesurant Abs260, l'équation Christian et Warburg pour l'énolase de
levure cristalline (Biochemische Zeitung 310, 384 (1941)) peut être appliquée:
Protéine (mg/ml) = 1.55 * Abs 280 - 0.76 * Abs 260
Cette équation peut être appliquée à d'autres protéines si les facteurs correspondants
sont connus. Pour adapter l'équation à une protéine particulière, les absorbances à
260 et 280 nm doivent être déterminées à des concentrations de protéines connues
pour générer des équations simultanées simples ; la résolution de ces équations
fournit les deux coefficients. Dans les cas où Facteur 2 est négatif, il doit être réglé
sur 0 étant donné que ceci signifie qu'il n'y a aucune contribution à la concentration
des protéines en raison de l'absorbance à 260 nm. L'utilisation de la correction de
bruit de fond à 320 nm est optionnelle.
Protéine (mg/ml) = (Facteur 1 * Abs 280) - (Facteur 2 * Abs 260)
Réglez le Facteur 2 = 0.00 pour la mesure directe des protéines UV λ280 ; Facteur 1 est
basé sur le coefficient d'extinction des protéines. Si l'albumine de sérum bovin (BSA)
est un standard acceptable, le réglage de Facteur 1 = 1,115 va donner des résultats
linéaires entre 0 et 0,8 mg/ml de protéines.
Protéine (mg/ml) = 1.115 * Abs 280
Des mesures rapides telles que celle-ci à Abs 280 sont particulièrement utiles après
l'isolement des protéines et des peptides à partir des mélanges en utilisant les
colonnes de piégeage par centrifugation et gravité, respectivement.
La procédure est la suivante:
•
Choisissez si la correction de bruit de fond à 320 nm est exigée en utilisant 4
•
Entrez le Facteur 1
•
Entrez le Facteur 2
•
Sauvegardez la méthode si nécessaire en utilisant 4
•
Insérez la référence et les échantillons, et appuyez sur run
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Français
Numéro 04 - 09/2002
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