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Préparer chaque échantillon avant le dosage en ajoutant le prétraitement à l'échantillon dans un rapport de 1:1
– par exemple 150 µL d'échantillon plus 150 µL de prétraitement. Les échantillons prétraités et munis d'un
couvercle peuvent être conservés entre 2 et 8 °C pendant 24 heures avant le dosage.
10.2 Protocole de dosage
1.
Puits de référence pour identification.
Pipeter 100 µL d'étalons en double, de témoins de la trousse en double et d'échantillons patients pré-traités
2.
(à 50:50) en double dans les puits appropriés. Ne pas oublier de changer d'embouts de pipettes entre les
différents ajouts. Cette étape ne doit pas durer plus de 15 minutes.
3.
Incuber 60 ± 10 minutes entre 18 et 25°C.
Décanter le contenu des barrettes par inversion rapide au-dessus d'un évier adapté à l'élimination des
4.
matériaux biologiques en gardant à l'esprit le risque infectieux potentiel des échantillons. Bien sécher les
barrettes retournées avec des serviettes en papier. Ne pas laver.
5.
Ajouter 100 µL de conjugué à chacun des puits.
6.
Incuber 35 ± 5 minutes entre 18 et 25°C.
Décanter le contenu des barrettes par inversion rapide au-dessus d'un évier adapté à l'élimination des
7.
matériaux biologiques. Bien sécher les barrettes retournées avec des serviettes en papier.
8.
Laver les puits cinq fois avec au moins 250 µL de tampon de lavage dilué. Décanter et sécher après
chaque ajout de lavage.
9.
Ajouter 100 µL de substrat à chacun des puits.
10. Incuber 30 ± 5 minutes entre 18 et 25°C. Ne pas décanter.
11. Ajouter 100 µL de solution d'arrêt à chacun des puits, dans le même ordre et au même débit que le substrat.
Tapoter doucement les puits pour mélanger.
12. Lire les barrettes à 405 nm. Lire le dosage 120 minutes maximum après ajout de la solution d'arrêt.
11. RÉSULTATS
11.1. Calcul et interprétation
Tracer la valeur moyenne d'absorbance de chaque étalon sur l'axe y par rapport à la concentration
correspondante en pmol/L sur l'axe x. LES CONCENTRATIONS DES ÉTALONS SONT INDIQUÉES SUR LES
ÉTIQUETTES DES FLACONS. DES VALEURS DE CONCENTRATION SONT ATTRIBUÉES À CHAQUE LOT
D'ÉTALONS ET PEUVENT VARIER D'UN LOT À L'AUTRE.
La concentration (pmol/L) de chaque échantillon peut être calculée en localisant le point de la courbe qui correspond
à la valeur moyenne d'absorbance de l'échantillon et en lisant la concentration correspondante en pmol/L sur l'axe x.
Cette procédure peut être exécutée manuellement à l'aide d'une feuille millimétrée ou d'un lecteur de microplaque dont
le logiciel est capable de mener à bien des procédures d'ajustement de courbe. En cas d'utilisation d'un lecteur de
microplaque avec logiciel interne, un algorithme d'ajustement de courbe par régression linéaire doit être utilisé.
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