PerkinElmer Lambda Bio Mode D'emploi page 74

74 . Lambda Bio/Bio+ Mode d'emploi
Pour les acides nucléiques, la lecture à 260 nm est réalisée à proximité du sommet d'un pic
large dans le spectre d'absorbance. La lecture à 280 nm est effectuée sur une pente abrupte,
dans laquelle de faibles changements de longueur d'onde provoquent d'importants
changements d'absorbance, ce qui a un effet plus marqué sur le rapport A260/A280 que des
variations à 260 nm. De fait, plusieurs instruments, du même type ou de types différents,
peuvent afficher des rapports légèrement différents en raison des variations dans la précision
de la longueur d'onde. Toutefois, un instrument donné doit fournir des résultats cohérents
entre eux.
Figure 12 Analyse spectrale d'acide nucléique
Noter les points suivants dans le spectre :
Absorbance maximale dans la région 260 nm, et absorbance minimale dans la région
•
230 nm ;
Pic plat vers 260 nm et pente abrupte à 280 nm ;
•
• Très faible absorbance à 320 nm.
La concentration de la solution a également un impact sur la précision des lectures
A260/A280. Si une solution est trop diluée, les lectures s'effectueront à la limite de détection
de l'instrument, et les résultats pourront varier dans la mesure où le pic à 260 nm et la pente
à 280 nm seront plus difficiles à distinguer de l'absorbance du fond. C'est l'une des raisons
pour lesquelles la valeur A260 doit être supérieure à 0,1 A pour obtenir des mesures précises.
Une absorbance élevée à 230 peut également indiquer la présence d'impuretés. La longueur
d'onde 230 nm est rpoche de l'absorbance maximale des liaisons peptidiques. L'EDTA et
autres sels tampons présentent de l'absorption à cette longueur d'onde. Pour la mesure
d'échantillons d'ARN, le rapport A260/A230 doit être >2.0. Un rapport plus faible est
généralement un signe de contamination au thiocyanate de guanidine, un réactif
fréquemment utilisé pour la purification d'ARN et qui a la propriété d'absorber au-delà de la
plage 230–260 nm. Une analyse de longueur d'onde de l'acide nucléique est particulièrement
utile pour les échantillons d'ARN.
Les méthodes pour acides nucléiques affichent les rapports A260/A280 et A260/A230 et
compensent la dilution et l'utilisation de cellules ayant un trajet optique différent de 10 mm.
Le facteur de dilution et le trajet optique de la cellule peuvent être indiqués.