Table des Matières
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6. Notez le volume total de la solution afin de pouvoir estimer le
degré d'évaporation et le corriger.
7. Chauffez la suspension d'agarose dans un four à micro-ondes
pendant 90 secondes. Agitez la fiole pour vous assurer que tous
les grains collant aux parois soient intégrés dans la solution.
L'agarose non dissoute ressemble à de petites « lentilles » flottant
dans la solution. Chauffez pendant encore 30 à 60 secondes.
Examinez de nouveau la solution et répétez le processus de
chauffe jusqu'à ce que l'agarose se dissolve complètement.
8. Ajoutez de l'eau désionisée pour remplacer tout volume perdu à
cause de l'évaporation pendant le processus de chauffe.
Passez à la Section C, Étape 1, « Coulage du gel » à la page 12.
B. Préparation du gel d'agarose et du tampon d'électrophorèse – ARN
Les molécules d'ARN sont séparées par électrophorèse grâce à des gels
dénaturants avant l'analyse par hybridation Northern. Les gels d'agarose contenant
(1, 2, 3)
du formaldéhyde
dessous se trouve un protocole général pour l'électrophorèse de l'ARN avec des
gels de formaldéhyde.
ATTENTION ! Tous les appareils et solutions utilisés dans le protocole
suivant doivent être traités avec du DEPC (pyrocarbonate de
diéthyle) ou de l'anhydride acétique avant utilisation pour
inhiber l'activité RNase (voir Section II, page 4 pour le
protocole). Il est recommandé de réaliser les solutions
spécialisées uniquement pour le travail avec l'ARN afin de
minimiser le risque de dégradation des échantillons due à
l'activité RNase.
REMARQUE : La coloration des échantillons d'ARN avec du bromure
d'éthidium s'est révélée réduire l'efficacité de transfert des
échantillons. Par conséquent, si des échantillons doivent être
analysés par hybridation Northern après une électrophorèse,
réalisez une ou des voies doubles pour la coloration, ou
minimisez l'exposition des échantillons d'ARN au bromure
d'éthidium en suivant le protocole de coloration post-
électrophorèse à la page 12.
Le protocole suivant permettra de réaliser 50 ml d'un gel d'agarose à 1,5 %
contenant du tampon 1X MOPS [3-(N-morpholino)-propane sulfonique]-Acétate-
EDTA (MAE) et du formaldéhyde 2,2 M, permettant d'obtenir un gel de 7,5 mm
d'épaisseur :
1. Pesez 0,5 g d'agarose, et placez-le dans une fiole de 125 ml.
2. Ajoutez 43,5 ml d'eau traitée par DEPC (ou avec de l'anhydride
acétique).
sont fréquemment utilisés pour l'électrophorèse de l'ARN. Ci-
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