Observations En Matière De Fluorimétrie; Effet De Température De L'échantillon; Réaction Photochimique Des Échantillons; Fluorescence Des Impuretés - Shimadzu RF-1501 Manuel D'instructions

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5.5.1 Effet de température de l'échantillon
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Dans de nombreux échantillons, on considère que chaque élévation de température de 1 °C entraîne
une perte de 1 à 2 % de l'intensité de fluorescence, bien que cela dépende du type d'échantillon.
Certains échantillons biochimiques génèrent même un changement de quelque 10 % en réponse à
une élévation de 1 °C. Les échantillons sensibles à la température doivent être testés dans le porte-
cuve à température constante.
5.5.2 Réaction photochimique des échantillons
Lorsqu'ils sont exposés à une lumière d'excitation, certains échantillons produisent une réaction
photochimique, ce qui se traduit par un changement de l'intensité de fluorescence. Aussi, pour tester
ces échantillons, il est conseillé de régler l'obturateur de sorte que l'échantillon ne soit exposé à la
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lumière d'excitation que pendant la durée de la mesure. D'autres techniques disponibles augmentent,
autant que possible, la vitesse de balayage du spectre ou rétrécissent la largeur de bande de la
lumière d'excitation.
5.5.3 Fluorescence des impuretés
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Les pics provoqués par des composants fluorescents autres que le composant d'intérêt lors de la
mesure du spectre de fluorescence sont désignés sous le nom de fluorescence des impuretés. La
fluorescence des impuretés est associée à 1 la lumière diffusée et à sa lumière secondaire, 2 la
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lumière diffusée Raman du solvant et 3 la fluorescence émanant du solvant ou de la cuve.
1 et 2 sont expliqués à la section 5.5.4. Dans le cas 3, des qualités de réactifs disponibles dans le
5 commerce détectent souvent la fluorescence provoquée par la présence d'impuretés dans le solvant.
Pour rappel, les tests de sensibilité élevée réalisés dans le domaine de l'ultraviolet sont
particulièrement sensibles aux effets de fluorescence des solvants. Des solvants sans fluorescence
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sont disponibles à des fins d'analyse par fluorescence. Pour éviter que les éventuels effets de
fluorescence des solvants constituent une source de préoccupation, il convient d'utiliser ces solvants
commerciaux ou de raffiner soi-même le solvant.
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Les cuves en quartz génériques produisent une faible fluorescence lorsqu'elles sont excitées à
environ 260 nm en raison des impuretés (aluminium) inhérentes aux cuves. Il est conseillé d'utiliser
une cuve sans fluorescence contenant du quartz artificiel (Réf. : 200-34594-03) pour exciter des
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traces d'échantillons à environ 260 nm.
5.5.4 Effets de lumière diffusée
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Dans le cadre des tests de fluorescence, outre les principaux composants de fluorescence, on peut
observer des pics provoqués par la lumière diffusée et la diffusion Raman. La lumière diffusée est
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associée à la diffusion de la lumière d'excitation par des molécules de solvant (diffusion de Rayleigh)
ou par des particules ou des bulles d'air ; la lumière diffusée qui en résulte pénétrant dans le
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monochromateur d'émission. La lumière diffusée se manifeste tout particulièrement lors du test
d'échantillons solides. Ces pics se distinguent facilement car ils apparaissent au niveau de la
longueur d'onde de la lumière d'excitation.
En fonction des caractéristiques du monochromateur à réseau, il se peut que la lumière diffusée
apparaisse également dans les zones de longueur d'onde correspondant à deux et trois fois la
longueur d'onde de la lumière d'excitation, respectivement sous la forme d'une lumière de second
ordre et de troisième ordre. Avec une longueur d'onde de lumière d'excitation de 220 nm, par
exemple, la lumière de second ordre apparaît à 440 nm et la lumière de troisième ordre, à 660 nm. Un
filtre de blocage de longueurs d'onde courtes est inséré du côté émission afin d'éliminer cette lumière.
De plus, si la longueur d'onde de la lumière d'excitation est définie sur la partie visible du spectre, le
monochromateur d'excitation émet également une lumière ayant la moitié de cette longueur d'onde.
Avec une longueur d'onde de lumière d'excitation de 450 nm, par exemple, une lumière de 225 nm est
également émise. Un filtre de blocage de longueurs d'onde courtes est inséré du côté excitation afin
5-6 SERIE RF-1501
Observations en matière de fluorimétrie
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