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V. Amplification
a - Déterminer le nombre d'échantillons à analyser, y compris les témoins utilisés (par
exemple les témoins positif et négatif d'extraction, les témoins positifs d'amplification
(« CTL+ ») et le témoin réactif d'amplification (NTC ou No Template Control)). Nombre final
de tubes : n.
b- Décongeler le réactif « A5 » à température ambiante. Vortexer. Préparation de la solution
d'amplification « A5 » :
Si extraction en ADIAPURE™ SLB :
Répartir 10 µl de réactif « A5 » dans chacun des tubes PCR ou puits de plaque PCR.
Si extraction autre que ADIAPURE™ SLB :
Placer (n+1)*10 µl de réactif « A5 » dans un microtube.
Y ajouter (n+1)*0,5 µl « EPC-Amp ».
Répartir 10 µl du mélange dans chacun des tubes PCR ou puits de plaque PCR.
c- Replacer immédiatement le tube « A5 » à <-15°C et à l'obscurité.
d- Pour chaque échantillon, le témoin négatif d'extraction (obligatoire) et le témoin positif
d'extraction (recommandé), ajouter 5 µl d'extrait purifié aux 10 µl de réactif « A5 ».
Pour les CTL+, ajouter 5 µl de la solution (§ II.3. ou § II.4.) aux 10 µl de réactif « A5 ».
Pour le témoin réactif d'amplification (NTC), ne rien ajouter au réactif « A5 ».
Replacer immédiatement les extraits d'ADN purifiés à +2/8°C ou <-15°C. Eliminer les bulles
qui pourraient rester au fond des puits.
e- Démarrer le run rapidement après la mise en place de la plaque ou des tubes dans le
cycleur.
La cible
iowea
fluorescent. Le mélange contient une référence passive ROX pour les appareils ABI. La lecture
de la fluorescence s'effectue pendant l'étape d'élongation (à 60°C).
Le programme suivant a été développé pour les appareils ABI Prism (type ABI7500, Step-one,
QS5...) d'Applied Biosystems (cocher l'option « emulation 9600 » lorsqu'elle existe), pour les
MX3005P, AriaMx d'Agilent et pour le CFX96 de Biorad :
*Mettre 32 secondes pour le ABI7500
Contactez-nous si vous souhaitez utiliser d'autres appareils.
Mycoplasma meleagridis
est lue en Cy5. Le contrôle interne est lu en VIC ou HEX. Le Quencher est non
Programme standard
2 min 50°C
10 min 95°C
15 sec
1 min
souches terrains est lue en FAM. La cible
Programme FAST
2 min. 95°C
5 sec 95°C
45 cycles
30 sec 60°C *
Mycoplasma
45 cycles
- 11 -
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