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Katalog-Nr. 00-8401
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SPOT-Light
Gewebevorbehandlungskit
Für Enzym- und Wärmevorbehandlung von FFPE-Gewebe vor CISH
Für den Gebrauch zur Wärmevorbehandlung und Ezym-Digestion von formalin-fixiertem, paraffin-eingebettetem (FFPE) Gewebe vor der
chromogenen in situ Hybridisierung (CISH) Detektion.
MITGELIEFERTE REAGENZIEN
1. Ein Liter Wärmevorbehandlungslösung, pH 7.0 (gebrauchsfertig)
2. Eine 10-mL-Flasche Enzymreagenz (gebrauchsfertig)
AUFBEWAHRUNG
Bei 2-8°C aufbewahren.
STABILITÄT
Nicht nach dem auf dem Behälter aufgedruckten Verfalldatum verwenden. Bei ordnungsgemäßer Aufbewahrung besteht keine signifikante
Leistungseinbuße. Alle anderen als die angegebenen Aufbewahrungsbedingungen müssen vom Benutzer validiert werden.
GEWEBEVORBEREITUNG
Die Objektträger sollten vor dem Aufziehen von Gewebeschnitten mit Haftmittel behandelt werden. Die Objektträger entparaffinisieren und
die Gewebeschnitte dehydrieren.
Gemäß den Empfehlungen in den der ISH-Probe beiliegenden Anleitungen Wärmevorbehandlung und Enzym-Digestion durchführen. Wenn die
Probenanleitungen nicht zur Verfügung stehen, kann das folgende Verfahren angewendet werden.
WÄRMEVORBEHANDLUNG
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1. Die 500 mL SPOT -Light
kocht oder 98-100°C erreicht. Die Objektträger 15 Minuten lang kochen (Hinweis: Je nach verwendetem Gewebefixierungsmittel können
verschiedene Inkubationszeiten erforderlich sein. Eine Inkubation von 15 Minuten ist ein empfohlener Ausgangspunkt).
2. 2 x 3 Minuten in PBS oder dH
ENZYM-DIGESTION
1. Das Gewebe für 10 Minuten bei RT mit 100-200 µL des Enzymreagenz (Reagenz 2) bedecken.
Hinweis: Je nach verwendetem Gewebefixierungsmittel können verschiedene Inkubationszeiten erforderlich sein. Übermäßige Digestion
bewirkt einen Verlust der Nuklei und Chromosomenstruktur. Details sind im Abschnitt zur Fehlerbehebung zu finden.
2. 2 x 3 Minuten bei RT in PBS oder dH
Die Objektträger in einer Serie von 70%, 85%, 95% und 100% Ethanol 2 Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft dehydrieren und dann
zur Denaturierung und Hybridisierung weiter gehen.
FEHLERBEHEBUNG
1. Wenn nicht anders angegeben, muss während des gesamten Verfahrens darauf geachtet werden, dass der Gewebeschnitt nicht austrocknet.
2. Wärmevorbehandlung (entscheidendster Schritt für erfolgreiche Durchführung der CISH):
Die Probe muss in der Wärmevorbehandlungslösung 15 Minuten lang gekocht oder bei über 98°C erhitzt werden.
3. Enzymatische Digestion (ein entscheidender Schritt für die erfolgreiche Durchführung der CISH): Je nach Gewebetyp und Fixierungsmethode
können verschiedene Enzyminkubationszeiten (5-15 Min) erforderlich sein. Für die meisten Brustgewebe werden die besten CISH-Ergebnisse
bei 10-minutiger enzymatischer Digestion bei Raumtemperatur erhalten. Sicherstellen, dass das Enzymvorbehandlungsreagenz vor der
Zugabe an den Gewebeschnitt auf RT aufgewärmt wird. Die Enzymvorbehandlung der Probe sollte bei Abschluss des CISH-Protokolls sofort
beurteilt werden. Falls die Zellkerne nicht gegengefärbt sind und das CISH-Signal fehlt oder sehr schwach ist, kann dies auf Zellkernverlust
aufgrund übermäßiger Digestion zurückführbar sein. Falls die Zellkerne stark gegengefärbt sind, aber in den Zellkernen kein CISH-Signal vorhanden
ist, kann dies auf eine Unterdigestion während der Pepsinvorbehandlung zurückführbar sein. Wenn keine optimalen Ergebnisse erhalten werden,
kann die Enzymvorbehandlung alternativ auch 3 Minuten lang bei 37°C durchgeführt werden.
4. Eine Probendenaturierung bei einer niedrigeren Temperatur als protokollsgemäß empfohlen kann zu einem schwachen bzw. fehlenden CISH-Signal
führen.
5. Hybridisierungen, die kürzer als protokollsgemäß sind, oder Stringenz-Wäschen, die bei höheren Temperaturen als protokollsgemäß durchgeführt
werden, können eine Abnahme oder einen vollständigen Verlust des CISH-Signals verursachen.
6. Weitere technische Unterstützung bzw. Produktliteratur sind von Ihrem örtlichen Vertrieb oder von Invitrogen unter
tech_support@invitrogen.com.
MARKE
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Zymed
und SPOT -Light
sind Marken von Invitrogen.
Bevollmächtigter Repräsentant für IVDD 98/79/EC:
Invitrogen Corporation • 542 Flynn Rd • Camarillo • CA 93012 • Tel: 800.955.6288 • E-mail:
PI008401
© 2007 Invitrogen Corporation. All right reserved. These products may be covered by one or more Limited Use Label Licenses (see the Invitrogen Catalog or www.invitrogen.com).
By use of these products you accept the terms and conditions of all applicable Limited Use Label Licenses.
Gewebevorbehandlungslösung (Reagenz 1) in einem Becherglas auf einer Kochplatte erhitzen, bis sie entweder
0 bei Raumtemperatur (RT) waschen.
2
0 waschen.
2
Invitrogen Ltd.
Inchinnan Business Park
3 Fountain Drive
Paisley
PA4 9RF
UK
www.invitrogen.com
techsupport@invitrogen.com
(Rev 12/09) DCC-09-1898
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