invitrogen 00-8401 Mode D'emploi page 4

N. Catalogo 00-8401
Kit per il trattamento preliminare dei tessuti SPOT-Light®
Per il trattamento preliminare enzimatico e termico di tessuti fissati in formalina ed inclusi in paraffina (FFPE) prima
dell'ibridizzazione cromogenica in situ (CISH)
Da usarsi per il trattamento preliminare termico e la digestione enzimatica di tessuti fissati in formalina ed inclusi in paraffina (Formalin-Fixed,
Paraffin-Embedded, FFPE) prima della rilevazione tramite ibridizzazione cromogenica in situ (Chromogenic In Situ Hybridization, CISH).
REAGENTI ACCLUSI
1. Un litro di soluzione per il trattamento preliminare termico, pH 7,0 (Pronta per l'uso)
2. Una boccetta da 10 mL di reagente enzimatico (Pronta per l'uso)
CONSERVAZIONE
Conservare a 2-8 °C.
STABILITÀ
Non usare dopo la data di scadenza riportata sul contenitore. Se si osservano le debite modalità di conservazione, non vi è alcuna perdita di
performance significativa. Qualsiasi condizione di conservazione diversa da quelle specificate deve essere convalidata dall'utente.
MODALITÀ D'USO:
PREPARAZIONE DEI TESSUTI
Prima del fissaggio delle sezioni tissutali, i vetrini dovrebbero essere trattati con un adesivo. Deparaffinizzare i vetrini e disidratare le sezioni
tissutali.
Eseguire il trattamento preliminare termico e la digestione enzimatica conformemente a quanto raccomandato nelle istruzioni allegate alla sonda
ISH. In mancanza delle istruzioni per la sonda, si può seguire la procedura riportata qui di seguito.
TRATTAMENTO PRELIMINARE TERMICO
1. Scaldare 500 mL la soluzione per il trattamento preliminare dei tessuti SPOT -Light
alla bollitura o al raggiungimento di 98-100°C. Bollire i vetrini per 15 minuti (Nota: il tempo di incubazione necessario potrebbe variare a
seconda del metodo di fissaggio dei tessuti impiegato. Si raccomanda un tempo di incubazione di 15 minuti quale punto di partenza).
2. Lavare in PBS o dH 0 a temperatura ambiente (TA) per 2 x 3 minuti.
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DIGESTIONE ENZIMATICA
1. Ricoprire il tessuto con 100-200 µL di reagente enzimatico (Reagente 2) per 10 min. a temperatura ambiente.
Nota: il tempo di incubazione necessario potrebbe variare a seconda del fissativo per tessuti impiegato. La digestione eccessiva comporta la perdita
di nuclei e struttura cromosomica. Per ulteriori informazioni si prega di consultare la sezione Risoluzione dei problemi.
2. Lavare in PBS o dH 0 a temperatura ambiente per 2 x 3 minuti.
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Disidratare i vetrini in etanolo al 70%, 85%, 95% e 100% per 2 minuti ciascuno a temperatura ambiente, lasciare asciugare spontaneamente e
quindi eseguire la denaturazione e l'ibridizzazione.
RISOLUZIONE DEI PROBLEMI.
1. Salvo indicazione contraria, è importante prevenire l'essiccamento della sezione tissutale nel corso dell'intera procedura.
2. Pretrattamento termico (trattasi della fase più importante ai fini di una performance soddisfacente della CISH): i vetrini/ provini devono
essere bolliti o scaldati ad una temperatura superiore ai 98°C per 15 min. nella Soluzione per il pretrattamento termico.
3. Digestione enzimatica (una fase importante ai fini di una performance soddisfacente della CISH): il tempo di incubazione (5-15 min.)
enzimatica necessario potrebbe variare a seconda del tipo di tessuto e del metodo di fissaggio impiegati. Per la maggior parte dei tessuti mammari,
una digestione enzimatica da 10 minuti a temperatura ambiente consente di conseguire i migliori risultati per CISH. Accertarsi di
preriscaldare il Reagente enzimatico per il pretrattamento a temperatura ambiente prima di applicarlo sulla sezione tissutale. Il
pretrattamento enzimatico del provino dovrebbe essere valutato immediatamente al completamento del protocollo CISH. Se i nuclei non sono
controcolorati e se il segnale CISH è assente o molto debole, ciò potrebbe essere riconducibile ad una perdita di nuclei causata da una digestione
eccessiva. Se i nuclei presentano una forte controcolorazione, ma in essi non vi è alcun segnale CISH, ciò potrebbe essere riconducibile ad una
digestione insufficiente durante il trattamento preliminare con la Pepsina. Quale alternativa, se non si conseguono dei risultati ottimali, si può anche
usare la digestione a 37°C per 3 minuti.
4. Una denaturazione della sonda ad una temperatura inferiore a quella raccomandata dal protocollo potrebbe causare la perdita o l'indebolimento del
segnale della CISH.
5. L'esecuzione dell'ibridizzazione per un periodo di tempo inferiore a quello raccomandato dal protocollo o l'esecuzione di un lavaggio di astringenza
ad una temperatura superiore a quella raccomandata dal protocollo potrebbe causare la perdita o l'indebolimento del segnale della CISH.
6. Per ricevere ulteriore assistenza tecnica o del materiale informativo sui prodotti, pregasi rivolgersi al proprio distributore di zona o a Invitrogen
inviando un messaggio di posta elettronica all'indirizzo tech_support@invitrogen.com.
MARCHIO COMMERCIALE
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Zymed e SPOT -Light sono marchi commerciali di proprietà di Invitrogen.
Rappresentante Autorizzato per IVDD 98/79/EC: Invitrogen Ltd.
PI008401
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(Reagente 1) in un becher o su una piastra riscaldante fino
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(Rev 12/09) DCC-09-1898