Broyage Avec Le Fast Prep; Filtration - Adiagene Adiapure Manuel D'instruction

c- Centrifuger 5 minutes à 7 500 g à température ambiante.
(d- optionnel : étape à effectuer lorsque les fèces ne sédimentent pas). Transférer 200 µl de
surnageant dans un microtube de 1,5 ml, ajouter 15 µl de Lysis Buffer L2. Incuber 10 minutes
à +70°C.

• Broyage avec le Fast Prep

a- Transférer 300 µl du surnageant dans un tube Glass Beads et ajouter 300 µl de Lysis Buffer
L1. Les tubes Lysing Matrix B (MP Biomedical) peuvent également être utilisés pour cette
étape.
b- Broyer 3 x 45 secondes à 4 m/sec.
c- Centrifuger 5 minutes à 7 500 g à température ambiante.
(d- optionnel : étape à effectuer lorsque les fèces ne sédimentent pas). Transférer 200 µl de
surnageant dans un microtube de 1,5 ml, ajouter 15 µl de Lysis Buffer L2. Incuber 10 minutes
à +70°C.

2. Filtration

Monter le système de filtration comme décrit en page 7.
a- Déposer 300 µl du surnageant sur le filtre F1. Vérifier l'alignement du filtre F1 par rapport
au filtre F2. Allumer la pompe. Le manomètre doit afficher une pression inférieure à 300 mbar
ou 25 lnHg.
(Rq : Lorsque des fèces ne sédimentent pas, après l'étape 1-d, déposer 215 µl de surnageant
sur le filtre F1)
b- Attendre quelques minutes (15 minutes maximum) que 90 à 100% du liquide soit filtré.
Tapoter légèrement sur le filtre F1 pour faire tomber les dernières gouttes dans le filtre F2.
c- Eteindre la pompe et revenir à une pression normale. Enlever le filtre F1 et le placer sur la
plaque support blanche. Transférer le filtre F2 sur le dessus du manifold.
Dans le cas du manifold bleu, enlever le socle blanc et le remplacer par le couvercle du filtre
F2, qui va servir de réceptacle.
d- Allumer la pompe. La pression affichée doit être environ 50 mbar ou 20 lnHg. Attendre 5 à
10 minutes que tout le liquide soit filtré, ne pas éteindre la pompe.
e- Ajouter 100 µl de Washing Buffer FW. Attendre 5 à 10 minutes que tout le liquide soit
filtré.
f- Ajouter 100 µl de Washing Buffer FW. Attendre 5 à 10 minutes que tout le liquide soit
filtré. Le Washing Buffer FW n'est pas inhibiteur de la PCR, le tampon d'élution (Elution Buffer
FE) peut être ajouté même avec un peu de liquide résiduel. Ne pas dépasser 20 minutes de
filtration totale sur le filtre F2.
g- Eteindre la pompe. Revenir à une pression normale, mettre la plaque F2 sur sa plaque
support bleue puis déposer 50 µl d'Elution Buffer FE dans chacun des puits du filtre F2
utilisés. Vortexer (agitation lente) le filtre F2 à température ambiante pendant 5 minutes.
h- Pendant l'agitation, répartir 50 µl d'Elution Buffer FE dans une microplaque ou dans
chacun des microtubes qui vont recevoir l'ADN extrait.
- 9 -